🦠 Escherichia coli in kosmetischen Mitteln — Nachweis nach Anreicherung in Eugon-LT-100-Bouillon und Isolierung auf MacConkey-Agar

Mikrobiologie PN-EN ISO 21150

Übersicht

ISO 21150:2015 gibt allgemeine Leitlinien für den Nachweis und die Identifizierung von Escherichia coli an — einem in kosmetischen Mitteln „spezifizierten" Mikroorganismus; die Liste der spezifizierten Mikroorganismen kann sich je nach Praxis und Vorschriften von Land zu Land unterscheiden. Das Verfahren beruht auf dem Nachweis von E. coli in einem nichtselektiven flüssigen Nährmedium (Anreicherungsbouillon) und der anschließenden Isolierung auf einem selektiven Agarmedium; je nach dem geforderten Nachweisniveau können andere Verfahren geeignet sein (z. B. Überimpfungen auf nichtselektive Nährmedien und Identifizierung mit Testsätzen). Wegen der Vielfalt der kosmetischen Mittel kann das Verfahren für manche Erzeugnisse nicht in jeder Einzelheit passen (z. B. für nicht mit Wasser mischbare) — dann kann ISO 18415 geeignet sein; alternative Verfahren (z. B. automatische) dürfen nach dem Nachweis der Gleichwertigkeit angewendet werden. Die Norm empfiehlt eine mikrobiologische Risikoanalyse, um festzulegen, auf welche Erzeugnisse sie anzuwenden ist; Erzeugnisse mit geringem Risiko (ISO 29621) sind u. a. solche mit niedriger Wasseraktivität, hydroalkoholische und solche mit extremem pH-Wert.

In Polen gilt sie als PN-EN ISO 21150:2016-01 mit der Änderung A1:2023-03 (sie ersetzte PN-EN ISO 21150:2010). In der Praxis der Laboratorien, die die mikrobiologische Reinheit kosmetischer Mittel untersuchen, gehört die Norm zu dem Satz PN-EN ISO (21149, 16212, 22718, 22717, 18416), der für quantitative und qualitative Untersuchungen angewendet wird; zur Überprüfung der Anwesenheit von E. coli wird ein Ausstrich auf das selektiv-differenzierende MacConkey-Nährmedium ausgeführt, auf dem diese Stäbchen dunkelrosa Kolonien mit einem dunkelrosa Rand bilden.

Prinzip der Methode

Die erste Stufe ist die Anreicherung in einer nichtselektiven Bouillon, die die Zahl der Mikroorganismen erhöht, ohne das Risiko einer Hemmung durch die selektiven Bestandteile selektiv-differenzierender Nährmedien; die zweite Stufe (Isolierung) wird auf einem selektiven Nährmedium geführt, wonach Identifizierungstests ausgeführt werden. Eine etwaige Hemmung des Wachstums der Mikroorganismen durch die Probe muss neutralisiert werden, um den Nachweis lebender Zellen zu ermöglichen — in jedem Fall und unabhängig von der Methodik ist die Neutralisation der antibakteriellen Eigenschaften des Erzeugnisses zu überprüfen und nachzuweisen (Abschnitt 11 der Norm, Eignungstest auf Casein-Soja-Agar). Die Probe besteht aus mindestens 1 g oder 1 ml des Erzeugnisses, das für die Herstellung der Erstverdünnung verwendet wird. Die in der Norm genannten Nährmedien: Trypton-Natriumchlorid-Lösung als Verdünnungsmittel der Bakteriensuspension, Casein-Soja-Agar für den Eignungstest, Eugon-LT-100-Bouillon für die Anreicherung (andere Anreicherungsbouillons sind zulässig), MacConkey-Agar für die Isolierung von E. coli (er enthält u. a. Neutralrot 30,0 mg und Kristallviolett 1,0 mg je Liter; nach dem Lösen wird er 1 min gekocht und 15 min bei 121 °C sterilisiert) sowie Eosin-Methylenblau-Agar nach Levine (EMB) für die Bestätigung (Eosin Y 400 mg und Methylenblau 65 mg je Liter; zu je 100 ml des verflüssigten Agars werden 5 ml einer 20%igen Lactoselösung, 2 ml 2%ige Eosin-Y-Lösung und 2 ml 0,033%ige Methylenblaulösung gegeben; Sterilisation 121 °C, 15 min). Alle Nährmedien werden im Autoklaven 15 min bei 121 °C sterilisiert.

Anwendungen

• Kontrolle der mikrobiologischen Reinheit kosmetischer Mittel — Nachweis von E. coli als spezifiziertem Mikroorganismus (Erzeugnisse auf Wasserbasis: Cremes, Lotionen, Gele)
• Chargenfreigabe kosmetischer Erzeugnisse und Untersuchungen von Rohstoffen
• Untersuchungen der mikrobiologischen Stabilität und der Wirksamkeit der Konservierung (im Satz mit PN-EN ISO 21149, 16212, 22717, 22718, 18416)
• Auftrags- und Werkslaboratorien der Kosmetikbranche; Erzeugnisse mit geringem Risiko (ISO 29621) nach einer Risikoanalyse

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 21150:2016-01 + A1:2023-03 (ISO 21150:2015 + Amd 1:2022)

Titel (PL)

Kosmetyki — Mikrobiologia — Wykrywanie obecności Escherichia coli

Title (EN)

Cosmetics — Microbiology — Detection of Escherichia coli

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Risikoanalyse und Probenvorbereitung

   Lege fest, ob das Erzeugnis der Untersuchung unterliegt (mikrobiologische Risikoanalyse, ISO 29621). Entnimm mindestens 1 g oder 1 ml des Erzeugnisses und stelle die Erstverdünnung in der Anreicherungsbouillon mit Neutralisatoren her.

2. Eignungstest (Neutralisation)

   Weise nach, dass die antibakteriellen Eigenschaften des Erzeugnisses neutralisiert wurden (Abschnitt 11 der Norm) — unter Verwendung einer Suspension des Referenzstamms in Trypton-NaCl-Lösung und von Casein-Soja-Agar.

3. Anreicherung

   Bebrüte die Erstverdünnung in der nichtselektiven Eugon-LT-100-Bouillon (oder einer anderen von der Norm zugelassenen Anreicherungsbouillon) unter den in der Norm angegebenen Bedingungen.

4. Isolierung

   Impfe aus der angereicherten Kultur MacConkey-Agar und bebrüte ihn; suche nach den für E. coli charakteristischen Kolonien (dunkelrosa mit dunkelrosa Rand).

5. Bestätigung und Identifizierung

   Impfe verdächtige Kolonien auf EMB-Agar nach Levine über und führe Identifizierungstests aus (z. B. Identifizierungstestsätze nach der Überimpfung auf ein nichtselektives Nährmedium).

6. Ergebnis

   Gib die Anwesenheit oder das Fehlen von E. coli in der untersuchten Probe des Erzeugnisses (1 g oder 1 ml) an, mit der Angabe der nachgewiesenen Neutralisation.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• E. coli kann pathogene Stämme umfassen — Arbeit unter den Bedingungen eines mikrobiologischen Labors, Autoklavieren der Kulturen
• Farbstoffe der Nährmedien (Kristallviolett, Eosin, Methylenblau) — Hautkontakt vermeiden, Handschuhe
• Heiße Nährmedien nach dem Kochen und dem Autoklavieren — Verbrennungsgefahr

Häufige Fragen