🦠 Wahrscheinlichste Keimzahl (MPN) intestinaler Enterokokken in Oberflächenwasser, Badegewässern und Abwasser mit dem miniaturisierten Verfahren — Verdünnungen der Probe in einem speziellen Verdünnungsmittel mit Meersalz, je 200 µl in die Vertiefungen von 96-Well-Mikrotiterplatten mit dehydratisiertem MUD/SF-Nährmedium, Bebrütung 36–72 h bei 44 °C ± 0,5 °C, Vertiefungen mit blauer Fluoreszenz unter UV 366 nm positiv, Ergebnis MPN/100 ml mit 95-%-Vertrauensbereich, PN-EN ISO 7899-1

Mikrobiologie PN-EN ISO 7899-1

Übersicht

WAS DIE NORM BESCHREIBT. Anwendungsbereich aus der PKN-Katalogkarte PN-EN ISO 7899-1:2002 (polnische Fassung), vollständig (unsere Übersetzung des polnischen Kartentextes): „Beschrieben wird ein Verfahren zum Nachweis der meisten intestinalen Enterokokken in Oberflächenwasser und Abwasser sowie zu ihrer Zählung durch Bestimmung ihrer wahrscheinlichsten Keimzahl — MPN“. Den Normtext lesen wir in der Probe ISO 7899-1:1998: Vorwort, Einleitung und die Abschnitte 4–10 (Prinzip, Geräte, Probenahme, Nährmedien, Durchführung, Angabe der Ergebnisse, Prüfbericht); die Seite mit den Abschnitten 1–3 (Anwendungsbereich, normative Verweisungen, Begriffe) ist in der Probe leer, und die Anhänge A–G (Programme zur MPN-Berechnung, Tabellen, Zusammensetzung des Meersalzes, Qualitätskriterien für das Nährmedium in Mikrotiterplatten — E, Herstellung von Kalibrier-Mikrotiterplatten — F) haben wir nicht.

NACH DEM TEXT VON ISO 7899-1:1998 (Vorwort, Einleitung, Abschnitte 4–10). Die Norm wurde von ISO/TC 147 „Wasserbeschaffenheit“, Unterkomitee SC 4 „Biologische Verfahren“ erarbeitet; die zweite Ausgabe ersetzte die erste (ISO 7899-1:1984). Reihe ISO 7899: Teil 1 — miniaturisiertes MPN-Verfahren durch Beimpfen eines Flüssigmediums, Teil 2 — Membranfiltrationsverfahren; die Anhänge E und F sind normativ, A, B, C, D und G informativ. Einleitung: Ziel ist die Bestimmung der wichtigsten intestinalen Enterokokken — E. faecalis, E. faecium, E. durans und E. hirae — die häufig im Kot von Menschen und Warmblütern vorkommen; gelegentlich werden andere fäkale Arten (E. avium, E. cecorum, E. columbae, E. gallinarum) und Stämme von Streptococcus bovis/equinus nachgewiesen, die in Umweltproben selten sind und schlecht wiedergefunden werden; die nicht fäkalen Arten E. casseliflavus und E. mundtii (z. B. aus pflanzlichem Material und manchen Industrieabwässern) werden als intestinale Enterokokken gezählt — sie bilden auf nichtselektivem Medium meist ein gelbes Pigment — was bei der Interpretation zu berücksichtigen ist. Prinzip (Abschnitt 4): die verdünnte Probe wird in eine Reihe von Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit dehydratisiertem Nährmedium eingeimpft; nach 36–72 h Bebrütung bei 44 °C ± 0,5 °C werden die Platten im Dunkeln unter UV-Licht 366 nm betrachtet; Enterokokken zeigt die Fluoreszenz aus der Hydrolyse von MUD (4-Methylumbelliferyl-β-D-glucosid) an; das Ergebnis wird als MPN/100 ml angegeben. Geräte (Abschnitt 5; Glasgeräte nach ISO 8199 sterilisiert): Heißluftsterilisator oder Autoklav; Brutschrank 44 °C ± 0,5 °C; Tunneltrockner oder Werkbank mit vertikaler Laminarströmung (vorzugsweise Klasse II); UV-Betrachtungskammer (Woodlampe 366 nm) — Warnung: UV reizt Haut und Augen, Handschuhe und Schutzbrille; tragbares Refraktometer (optional); pH-Meter ±0,1; Reagenzgläser 16 × 160 mm und 20 × 200 mm; 8-Kanal-Mehrkanalpipette oder ein anderes System, das 200 µl je Vertiefung dosiert, und sterile Spitzen; Membranfiltrationsgerät mit 0,2-µm-Filtern zur Sterilisation der Nährmedien; sterile 96-Well-Mikrotiterplatten 350 µl, Flachboden, nicht fluoreszierend; sterile Klebefolien zum Verschließen; sterile Petrischalen 90 mm. Probenahme (Abschnitt 6): nach ISO 8199 sowie ISO 5667-1, -2 und -3. Nährmedien und Verdünnungsmittel (Abschnitt 7): aus Bestandteilen gleichbleibender Qualität oder fertig dehydratisiert; destilliertes oder demineralisiertes Wasser ohne wachstumshemmende oder -fördernde Stoffe; nicht sofort verwendet — im Dunkeln bei (5 ± 3) °C bis zu einem Monat. Spezielles Verdünnungsmittel SD (7.2.1): synthetisches Meersalz 22,5 g, optional 10 ml Bromphenolblaulösung (0,04 g in 100 ml Ethanol 50 % — nur zur Färbung, um Verwechslung mit Wasser zu vermeiden), Wasser auf 1000 ml; Autoklavieren bei 121 °C ± 3 °C für 15–20 min; reine NaCl-Lösung ist ungeeignet (deutliche Hemmung); typische Zusammensetzung des Meersalzes — Anhang C. MUD/SF-Nährmedium (7.3): Lösung A — Tryptose 40 g, KH2PO4 10 g, D(+)-Galactose 2 g, Polyoxyethylensorbitanmonooleat (Tween 80) 1,5 ml, Wasser 900 ml, unter Erwärmen gelöst und zum Sieden gebracht; Lösung B — NaHCO3 4 g, Nalidixinsäure 250 mg, Wasser 50 ml; Lösung C — Thallium(I)-acetat 2 g, 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid 0,1 g, Wasser 50 ml; Lösung D — MUD 150 mg in 2 ml N,N-Dimethylformamid; Warnung: Thalliumacetat und N,N-Dimethylformamid sind giftig — Arbeiten im Abzug; Herstellung: Mischen von A + B + C + D, pH 7,5 ± 0,2, Sterilisation durch Filtration 0,2 µm, Verteilen von je 100 µl in die Vertiefungen der Mikrotiterplatten (Fassungsvermögen mindestens 350 µl) und sofortiges Dehydratisieren im Tunneltrockner oder in der Laminarflow-Werkbank; die Herstellung des Nährmediums muss die Qualitätskriterien von Anhang E erfüllen. Wahl der Verdünnungen (8.1, Tabelle 1, vom Bild der Seite 4 abgelesen): Badegewässer — 2 Verdünnungen: 64 Vertiefungen 1/2 und 32 Vertiefungen 1/20, Messgrenzen 15 bis 3,5 × 10⁴ Bakterien/100 ml; andere Oberflächengewässer — 4 Verdünnungen zu je 24 Vertiefungen (1/2, 1/20, 1/200, 1/2000), 40 bis 3,2 × 10⁶/100 ml; Abwasser und Kläranlagen — 6 Verdünnungen: 16 Vertiefungen 1/2 bis 16 Vertiefungen 1/200 000, 60 bis 6,7 × 10⁸/100 ml. Verdünnungen (8.2; vorzugsweise in einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank — Aerosole): Süß- und Brackwasser (Salzgehalt < 30 g/kg, mit Refraktometer) — je 9 ml Verdünnungsmittel SD in den Röhrchen, 9 ml der gemischten Probe in das erste Röhrchen (1/2), 1 ml in das zweite (1/20), weiter in Schritten von 1/10; Meerwasser (Salzgehalt > 30 g/kg) — im ersten Röhrchen 9 ml destilliertes oder demineralisiertes Wasser statt SD, in den folgenden SD. Beimpfen (8.3.1): der Röhrcheninhalt wird in eine sterile Petrischale (mindestens 90 mm) gegossen und mit der 8-Kanal-Pipette zu je 200 µl in die dieser Verdünnung zugeordneten Vertiefungen verteilt, wobei für jede Verdünnung Schale und Spitzen gewechselt werden; ein Überlaufen zwischen den Vertiefungen ist zu vermeiden. Bebrütung (8.3.2): die Platte wird mit steriler Folie verschlossen und bei 44 °C ± 0,5 °C mindestens 36 h und höchstens 72 h bebrütet, ohne Kippen. Ablesung (8.4): die Platten mit Folie in der UV-Kammer; Vertiefungen mit blauer Fluoreszenz sind positiv; Ablesen ist jederzeit nach 36 h möglich, da sich die Fluoreszenz nicht verändert. Ergebnisse (Abschnitt 9): für jede Verdünnung die Zahl der positiven Vertiefungen; charakteristische Zahl, z. B. Badegewässer 64+/64 und 5+/32 → 32/5; Oberflächengewässer 24/24, 18/24, 5/24, 1/24 → 18/5/1; Abwasser 16, 16, 12, 5, 0, 0 (von 16) → 12/5/0; bei drei und mehr Verdünnungen — eine dreistellige Zahl, möglichst auf 0 endend, nach ISO 8199. Die MPN ist eine statistische Schätzung der Dichte unter Annahme einer Poisson-Verteilung, mit Vertrauensbereich; die Programme der Anhänge A oder B geben die MPN je Milliliter und den 95-%-Bereich an; Beispiele: 32/5 → 7,56/ml, Bereich 5,42–10,54, d. h. 756/100 ml (542–1054); 18/5/1 → 159,08/ml (101,99–248,11); 12/5/0 → 1724,61/ml (1003,98–2962,50); ohne positive Vertiefungen lautet das Ergebnis „< n/100 ml“, wobei n die MPN für eine positive Vertiefung in der verwendeten Anordnung ist. Prüfbericht (Abschnitt 10): Angaben zur Identifizierung der Probe, Verfahren und Ergebnisse.

STATUS (Stand der Karte 02.10.2026). Die Karte PN-EN ISO 7899-1:2002 (polnische Fassung) trägt keinen Vermerk „Zurückgezogen“ — die Norm ist GÜLTIG: Veröffentlichung 20-12-2002, 45 Seiten, Preisgruppe S, Sektor Gesundheit, Umwelt und Medizin, KT 120 Wasserbeschaffenheit — Mikrobiologische und biologische Prüfungen, ICS 07.100.20, „Führt ein: EN ISO 7899-1:1998 [IDT], EN ISO 7899-1:1998/AC:2000 [IDT], ISO 7899-1:1998/Cor 1:2000 [IDT], ISO 7899-1:1998 [IDT]“. Die PKN-Suche nach „PN-EN ISO 7899-1“ (02.10.2026) zeigt nur diese Karte. Den Inhalt der Berichtigung Cor 1:2000 kennen wir nicht. Ob ISO an einer neuen Ausgabe arbeitet, haben wir nicht geprüft (iso.org verweigert den Zugriff von unserem Server).

RECHTSAKT. Richtlinie 2006/7/EG über die Qualität der Badegewässer und deren Bewirtschaftung, Anhang I (Originaltext und neueste konsolidierte Fassung in der Datenbank CELLAR, 01.01.2014): für intestinale Enterokokken sind die Referenzanalyseverfahren „ISO 7899-1 oder ISO 7899-2“; Werte für Binnengewässer: ausgezeichnete Qualität 200, gute 400 (95. Perzentil), ausreichende 330 (90. Perzentil) KBE/100 ml; für Küsten- und Übergangsgewässer 100, 200 und 185 KBE/100 ml. Die polnische Verordnung über die Überwachung der Badegewässerqualität haben wir nicht gelesen — wir geben nicht an, wie sie diese Verfahren umsetzt.

WIE VIELE LABORATORIEN UND IN WELCHER SCHREIBWEISE (Kopie der Datenbank der Akkreditierungsumfänge, Datenstand bis 17.09.2026, gelesen 02.10.2026). Die Nummer 7899-1 steht in 8 Datensätzen bei 8 Laboratorien: AB 216, AB 313, AB 521, AB 560, AB 565, AB 589, AB 631, AB 680. In den aktuellen Umfängen auf der PCA-Website (gelesen 02.10.2026, Ausgaben vom 11.07.2025 bis 07.08.2026) steht die Nummer bei allen 8 als „PN-EN ISO 7899-1:2002“, bei AB 313 geschrieben „PN-EN-ISO 7899-1:2002“ (mit Bindestrich nach EN). Keine Zeile ist fett kursiv gesetzt. Der Reiter „Laboratorien“ sucht Einträge, die MIT dem eingegebenen Text BEGINNEN: unter „PN-EN ISO 7899-1“ zeigt er 7 Laboratorien und 7 Positionen, unter „PN-EN-ISO 7899-1“ — AB 313 — geprüft mit Abfragen des Reiters auf dem Produktivserver labcoda.pl am 02.10.2026.

WAS DIE LABORATORIEN PRÜFEN (Positionen bei PCA). Wasser, Wasser in Badegewässern und gelegentlich zum Baden genutzten Stellen (AB 216, AB 313, AB 521), Oberflächenwasser (AB 560, AB 589), Wasser (AB 565, AB 631, AB 680) — „wahrscheinlichste Keimzahl intestinaler Enterokokken, miniaturisiertes Verfahren (MPN)“; bei AB 680 „Enterokokken (Fäkalstreptokokken)“. Überall steht in der benachbarten Position PN-EN ISO 9308-3:2002 (MPN von Escherichia coli, miniaturisiertes Verfahren).

WO MAN LEICHT EIN SCHEINBAR RICHTIGES ERGEBNIS ERHÄLT. Beim Verdünnungsmittel: das Verdünnungsmittel SD enthält Meersalz — eine reine NaCl-Lösung hemmt das Wachstum deutlich; bei Meerwasser (Salzgehalt > 30 g/kg) wird die erste Verdünnung mit destilliertem Wasser hergestellt, nicht mit SD. Bei der Verdünnungsanordnung: Zahl der Verdünnungen und Vertiefungen hängt von der Wasserart ab (Tabelle 1) — die Anordnung für Badegewässer (obere Grenze 3,5 × 10⁴) ergibt bei Abwasser ein Ergebnis „über dem Bereich“. Bei der Ablesung: ein positives Ergebnis ist blaue Fluoreszenz unter UV 366 nm, im Dunkeln; nicht fäkale Arten (E. casseliflavus, E. mundtii) ergeben ebenfalls ein positives Ergebnis — bei Wässern mit pflanzlichem Material oder Industrieabwässern erhöhen sie die Zahl der „intestinalen Enterokokken“. Bei der Berechnung: die charakteristische Zahl wird nach ISO 8199 gewählt (bei drei Verdünnungen — drei Ziffern, möglichst auf 0 endend); die MPN aus dem Programm wird je ml angegeben — Umrechnung auf 100 ml und Vertrauensbereich sind zusammen anzugeben. Beim Nährmedium: die Herstellung der Mikrotiterplatten muss die Kriterien von Anhang E erfüllen — Platten, die die Kriterien nicht erfüllen, ergeben scheinbar richtige MPN. Bei der Arbeit: Thalliumacetat und N,N-Dimethylformamid sind giftig.

WAS WIR NICHT ANGEBEN. Wir haben nicht die Abschnitte 1–3 (leere Seite in der Probe) und nicht die Anhänge A–G — wir geben daher keine MPN-Tabellen, Berechnungsprogramme, Qualitätskriterien für das Nährmedium in Mikrotiterplatten (Anhang E), keine Herstellung von Kalibrier-Mikrotiterplatten (Anhang F) und keine Präzisionsdaten an.

Prinzip der Methode

Die verdünnte Wasserprobe wird zu je 200 µl in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit dehydratisiertem MUD/SF-Nährmedium gegeben; nach 36–72 h bei 44 °C hydrolysieren Enterokokken 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucosid, und die Vertiefungen fluoreszieren unter UV-Licht 366 nm blau; aus der Zahl der positiven Vertiefungen in den aufeinanderfolgenden Verdünnungen wird die wahrscheinlichste Keimzahl (MPN) je 100 ml mit 95-%-Vertrauensbereich berechnet.

Anwendungen

• Badegewässer und gelegentlich zum Baden genutzte Stellen — intestinale Enterokokken; die Richtlinie 2006/7/EG nennt ISO 7899-1 oder ISO 7899-2 als Referenzverfahren
• Oberflächengewässer — MPN intestinaler Enterokokken (4 Verdünnungen, 40 bis 3,2 × 10⁶/100 ml)
• Abwasser und Kläranlagen — bis zu 6 Verdünnungen (60 bis 6,7 × 10⁸/100 ml)
• Meer- und Brackwasser — gesondertes Verdünnungsverfahren bei Salzgehalt > 30 g/kg

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 7899-1:2002 (wersja polska; EN ISO 7899-1:1998 z AC:2000 IDT, ISO 7899-1:1998 z Cor 1:2000 IDT)

Titel (PL)

Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe enterokoków kałowych — Część 1: Zminiaturyzowana metoda do badania wód powierzchniowych i ścieków (najbardziej prawdopodobna liczba bakterii)

Title (EN)

Water quality — Detection and enumeration of intestinal enterococci in surface and waste water — Part 1: Miniaturized method (Most Probable Number) by inoculation in liquid medium

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Probe und Verdünnungen

   Probenahme nach ISO 8199 und ISO 5667; Verdünnungsanordnung nach Tabelle 1; Süß- und Brackwasser — SD ab dem ersten Röhrchen, Meerwasser (> 30 g/kg) — erstes Röhrchen mit destilliertem Wasser. PN-EN ISO 7899-1:2002 gültig (Stand der Karte 02.10.2026).

2. Beimpfen

   Jede Verdünnung in eine sterile Petrischale gegossen und mit der 8-Kanal-Pipette zu je 200 µl in die Vertiefungen mit MUD/SF-Nährmedium verteilt; neue Schale und Spitzen für jede Verdünnung.

3. Bebrütung

   Verschließen der Platte mit steriler Folie; 44 °C ± 0,5 °C über 36–72 h, ohne Kippen.

4. Ablesung

   In der UV-Kammer bei 366 nm, im Dunkeln, Platte mit Folie; Vertiefungen mit blauer Fluoreszenz — positiv.

5. Berechnung

   Charakteristische Zahl nach ISO 8199; MPN je ml und 95-%-Bereich aus dem Programm (Anhang A oder B), Umrechnung auf 100 ml; keine positiven — „< n/100 ml“.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Die Norm warnt: Thalliumacetat und N,N-Dimethylformamid sind giftig (chemischer Abzug), UV reizt Haut und Augen (Handschuhe, Schutzbrille); Verdünnen und Pipettieren vorzugsweise in einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank (Aerosole); Abwasserproben — infektiöses Material
• FACHLICHER HINWEIS: nicht fäkale Arten (E. casseliflavus, E. mundtii) werden als intestinale Enterokokken gezählt — bei Wässern mit pflanzlichem Material und Industrieabwässern ist dies bei der Interpretation zu berücksichtigen; reines NaCl statt Meersalz hemmt das Wachstum

Häufige Fragen