🦠 Intestinale Enterokokken im Wasser — MPN-Verfahren mit enzymatischem Nährmedium (β-D-Glucosidase; Enterolert-DW / Quanti-Tray)

Mikrobiologie PN-EN ISO 7899-3

Übersicht

ISO 7899-3:2025 legt ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der intestinalen Enterokokken im Wasser fest — darunter Enterococcus faecalis, E. faecium, E. durans, E. avium, E. gallinarum, E. hirae und E. casseliflavus —, das auf dem Wachstum der Zielorganismen in einem flüssigen Nährmedium und der Berechnung der wahrscheinlichsten Keimzahl (MPN) aus Tabellen oder mit Programmen beruht. Es wird für Trinkwasser und Badegewässer (Süß- und Meerwasser) sowie für andere ähnliche Wässer angewendet, auch für solche mit einem beträchtlichen Gehalt an Schwebstoffen; es erlaubt, Enterokokken auf einem Niveau von 1 KBE/100 ml nachzuweisen, mit einem endgültigen Ergebnis innerhalb von (26 ± 2) h selbst bei einer hohen Zahl heterotropher Bakterien. Badegewässer werden am besten nach einer Verdünnung 1:10 untersucht. Der Test beruht auf der Expression des Enzyms β-D-Glucosidase und liefert nach 24 h ein bestätigtes Ergebnis ohne weitere Untersuchung der positiven Vertiefungen. Die Norm gilt nicht für abgefülltes Wasser, für das das Verfahren nicht validiert wurde — das Laboratorium kann es dort nach eigener Validierung anwenden. Die Norm stützt sich auf ein validiertes Produkt mit festgelegten Merkmalen (Anhang C) und verlangt die Anwendung von ISO 8199, ISO 11133 und ISO 19458 (Probenahme). Das Vorkommen von intestinalen Enterokokken dient der Beurteilung der Wirksamkeit der Aufbereitung bei der Trinkwassergewinnung und weist auf das Eindringen von Verunreinigungen und auf Undichtigkeiten in den Speicher- und Verteilungssystemen hin.

Der Hersteller des Nährmediums Enterolert-DW (IDEXX) beschreibt den Test als auf der Technologie der definierten Substrate (DST) beruhend, mit dem Indikator-Nährsubstrat ortho-Nitrophenyl-β-D-glucosid: wenn die Enterokokken das Substrat verstoffwechseln, ändert sich die Färbung der Probe von Blau nach Grün — jeder Umschlag nach Grün ist ein positives Ergebnis, ohne dass eine UV-Lampe nötig wäre. Bebrütung bei 41 ± 0,5 °C für 24 h, die Ergebnisse sind bis 28 h gültig (sofern die örtlichen Vorschriften nichts anderes bestimmen); ein positives Ergebnis vor 24 h ist gültig, ein negatives nach 28 h ebenfalls. Das Nährmedium wird bei 2–25 °C ohne Licht und Feuchtigkeit aufbewahrt; der Test ist für Trinkwasser bestimmt, für andere Wässer nach einer Validierung im Laboratorium. In Polen gilt die Norm als PN-EN ISO 7899-3:2025-11.

Prinzip der Methode

Die intestinalen Enterokokken wachsen in einem flüssigen Nährmedium, das ein Indikator-Nährsubstrat für die β-D-Glucosidase enthält; der Abbau des Substrats (ortho-Nitrophenyl-β-D-glucosid) ändert die Farbe des Nährmediums von Blau nach Grün. Die Probe mit dem Nährmedium wird in ein Quanti-Tray gefüllt, versiegelt und bebrütet; nach (26 ± 2) h (Hersteller: 41 ± 0,5 °C für 24 h, Ablesung bis 28 h) werden die grünen Vertiefungen als positiv gezählt — ohne weitere Bestätigung — und aus MPN-Tabellen oder einem Programm (z. B. dem MPN-Generator des Herstellers) wird die wahrscheinlichste Zahl der intestinalen Enterokokken je 100 ml abgelesen. Das Verfahren weist 1 KBE/100 ml in Gegenwart einer hohen Zahl heterotropher Bakterien nach; Badegewässer (Süß- und Meerwasser) werden 1:10 verdünnt. Das Nährmedium ist in Einzelpackungen gebrauchsfertig und enthält keine toxischen Bestandteile; für den Vergleich bei der Ablesung wird eine Negativkontrolle verwendet (es gibt keinen Farbstandard). Die allgemeinen Grundsätze der kulturellen Untersuchungen (ISO 8199), der Qualität der Nährmedien (ISO 11133) und der Probenahme (ISO 19458) gelten.

Anwendungen

• Trinkwasser — Kontrolle der Wirksamkeit der Aufbereitung und der Dichtheit des Verteilungsnetzes (Ergebnis nach 24 h)
• Badegewässer, Süß- und Meerwasser (Verdünnung 1:10), Wässer mit einem hohen Gehalt an Schwebstoffen
• Wässer mit einem hohen Hintergrund heterotropher Bakterien, bei denen die Membranfiltration (ISO 7899-2) erschwert ist
• Laboratorien der Wasserwerke und der Sanitär- und Epidemiologiestationen — keine Bestätigung der positiven Vertiefungen
• Abgefülltes Wasser — ausschließlich nach eigener Validierung des Laboratoriums (außerhalb des Anwendungsbereichs der Norm)

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 7899-3:2025-11 (ISO 7899-3:2025)

Titel (PL)

Jakość wody — Oznaczanie ilościowe enterokoków jelitowych — Część 3: Metoda najbardziej prawdopodobnej liczby

Title (EN)

Water quality — Enumeration of intestinal enterococci — Part 3: Most probable number method

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Probenahme

   Nimm die Probe nach ISO 19458; verdünne Badegewässer (Süß- und Meerwasser) 1:10.

2. Zugabe des Nährmediums

   Gib das Reagenz Enterolert-DW zur Probe im sterilen Gefäß, verschließe es und schüttle, um den Inhalt bis zur Auflösung zu mischen.

3. Füllen und Versiegeln

   Gieße die Probe mit dem Nährmedium in ein Quanti-Tray und versiegle es im Siegelgerät.

4. Bebrütung

   Bebrüte (26 ± 2) h; nach Angaben des Herstellers 41 ± 0,5 °C für 24 h, Ablesung bis 28 h gültig.

5. Ablesung

   Erkenne die Vertiefungen als positiv an, in denen die Farbe von Blau nach Grün umgeschlagen ist (jeder Umschlag nach Grün); vergleiche mit der Negativkontrolle. Ein positives Ergebnis vor 24 h ist gültig; das Ausbleiben der Grünfärbung nach 28 h ist ein gültiges negatives Ergebnis, eine grüne Färbung nach 28 h erfordert eine Wiederholung.

6. Berechnung und Prüfbericht

   Lies aus der Zahl der positiven Vertiefungen die MPN der intestinalen Enterokokken je 100 ml aus den Tabellen oder mit einem MPN-Programm ab; berücksichtige bei einer Verdünnung den Faktor. Gib das Verfahren, die Kennzeichnung der Probe und das Ergebnis an.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Intestinale Enterokokken weisen auf eine fäkale Verunreinigung hin — Arbeit unter den Bedingungen eines mikrobiologischen Laboratoriums, Autoklavieren der gebrauchten Trays
• Das Siegelgerät wird heiß — die Heizelemente nicht berühren
• Das Nährmedium enthält keine toxischen Bestandteile (nach Angaben des Herstellers); die allgemeinen Arbeitsschutzregeln für Reagenzien sind einzuhalten

Häufige Fragen