🦠 Fäkale Enterokokken im Wasser
Kurz gefasst
Nachweis und quantitative Bestimmung von intestinalen Enterokokken im Wasser mittels Membranfiltration auf Slanetz-Bartley-Medium mit Bestätigung auf Galle-Äsculin-Azid-Agar. Die Prüfung erfolgt nach PN-EN ISO 7899-2:2004; Ergebnis: KBE/100 mL (koloniebildende Einheiten). Das Verfahren umfasst 10 Schritte (insgesamt rund 1 Tage 19 Std. 37 Min.–2 Tage 3 Std. 37 Min.); eingesetzt wird sie unter anderem für: Kontrolle der Trinkwasserqualität (Gesetzblatt 2017 — Enterokokken: 0 KBE/100 mL), Überwachung von Badegewässern (Richtlinie 2006/7/EG), Untersuchung von Flaschen- und Quellwasser.
Auf einen Blick
- Norm: PN-EN ISO 7899-2:2004
- Kategorie: Mikrobiologie
- Verfahrensschritte: 10
- Gesamtdauer der Schritte: 1 Tage 19 Std. 37 Min.–2 Tage 3 Std. 37 Min.
- Ergebnis: KBE/100 mL (koloniebildende Einheiten)
- Zulässiger Wert (Trinkwasser): 0 KBE/100 mL
- Isolierungstemperatur: 36 ± 1°C (vorläufige Stufe)
Übersicht
Intestinale Enterokokken sind eine Gruppe von Bakterien der Gattung Enterococcus — hauptsächlich E. faecalis und E. faecium — die natürlicherweise den Magen-Darm-Trakt von Menschen und Warmblütern besiedeln. Sie sind ein anerkannter Indikator für fäkale Kontamination von Wasser, komplementär zu E. coli, zeichnen sich jedoch durch eine weitaus größere Resistenz gegenüber Umweltbedingungen, Chlorierung und Austrocknung aus.
Enterokokken sind ein besonders wertvoller Indikator in Situationen, in denen E. coli einer schnellen Inaktivierung unterliegen kann — in Meerwasser, Wasser nach intensiver Desinfektion und bei der Beurteilung alter fäkaler Kontamination. Die Überlebensfähigkeit von Enterokokken in der aquatischen Umgebung ist länger als die von E. coli, was sie zu einem besseren Marker für die Wirksamkeit von Aufbereitungsprozessen macht.
Die Methode nach PN-EN ISO 7899-2 umfasst zwei Stufen: vorläufige Isolierung auf Slanetz-Bartley-Medium (Agar mit Natriumazid und Triphenyltetrazoliumchlorid — TTC) und Bestätigung auf Galle-Äsculin-Azid-Agar (BEA). Enterokokken reduzieren TTC zu rotem Formazan und bilden charakteristische rote bis burgunderfarbene Kolonien. Auf BEA hydrolysieren sie Äsculin, was zu einer dunkelbraunen bis schwarzen Verfärbung um die Kolonien führt.
Enterokokken sind ein Pflichtparameter bei der Trinkwasseruntersuchung (Gesundheitsministerium-Verordnung) mit einem zulässigen Wert von 0 KBE/100 mL. Sie sind auch bei der Überwachung von Badegewässern (Richtlinie 2006/7/EG) und bei Flaschenwasser vorgeschrieben.
Prinzip der Methode
Die Wasserprobe wird durch eine 0,45-µm-Membran filtriert, die Bakterien zurückhält. Die Membran wird auf Slanetz-Bartley-Medium aufgelegt und bei 36±1°C für 40–48 h inkubiert. Das Medium enthält Natriumazid (Hemmer gramnegativer Bakterien) und 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC), das Enterokokken zu unlöslichem rotem Formazan reduzieren — vorläufige Kolonien sind rot, burgundfarben oder rosa. Anschließend wird die Membran auf Galle-Äsculin-Azid-Agar (BEA) übertragen und bei 44±0,5°C für 2 h inkubiert. Enterokokken hydrolysieren das Glykosid Äsculin zu Äsculetin, das mit Eisenionen im Medium reagiert und einen dunkelbraunen bis schwarzen Komplex bildet — Ergebnisbestätigung.
Anwendungen
- Kontrolle der Trinkwasserqualität (Gesetzblatt 2017 — Enterokokken: 0 KBE/100 mL)
- Überwachung von Badegewässern (Richtlinie 2006/7/EG)
- Untersuchung von Flaschen- und Quellwasser
- Bewertung der Wirksamkeit der Wasserdesinfektion (Chlorierung, UV, Ozonung)
- Überwachung von Meerwasser und Brackwasser — bessere Überlebensfähigkeit als E. coli
- Untersuchung von Grundwasser und Infiltrationsanlagen
- Kontrolle der Schwimmbadwasserqualität
Schlüsselparameter
| Parameter | Wert |
|---|---|
| Ergebnis | KBE/100 mL (koloniebildende Einheiten) |
| Zulässiger Wert (Trinkwasser) | 0 KBE/100 mL |
| Isolierungstemperatur | 36 ± 1°C (vorläufige Stufe) |
| Bestätigungstemperatur | 44 ± 0,5°C (Bestätigungsstufe) |
| Inkubationszeit | 40–48 h (Isolierung) + 2 h (Bestätigung) |
| Probenvolumen | 100 mL (Standard) |
Norm
- Normnummer
- PN-EN ISO 7899-2:2004
- Titel (PL)
- Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe enterokoków kałowych — Część 2: Metoda filtracji membranowej
- Title (EN)
- Water quality — Detection and enumeration of intestinal enterococci — Part 2: Membrane filtration method
Schritt-für-Schritt-Verfahren
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Arbeitsplatzvorbereitung
Filtrationsanlage sterilisieren. Slanetz-Bartley- und BEA-Platten vorbereiten. Brutschranktemperaturen prüfen (36°C und 44°C).
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Chlorneutralisierung
Natriumthiosulfat zur chlorhaltigen Probe hinzufügen (1,8 %-Tablette). Vorsichtig mischen.
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Membranfiltration
Sterilen 0,45-µm-Filter auf den Trichter legen. 100 mL Probe filtrieren. Trichter mit 20 mL sterilem Peptonwasser nachspülen.
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Vorläufige Stufe — Slanetz-Bartley
Filter auf Slanetz-Bartley-Medium übertragen. Bei 36±1°C für 40–48 Stunden inkubieren.
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Ablesung vorläufiger Kolonien
Rote, burgundfarbene oder rosa Kolonien zählen (TTC-Reduktion zu Formazan). Anzahl und Verteilung der Kolonien notieren.
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Bestätigungsstufe — BEA
Membran mit Kolonien auf BEA-Agaroberfläche übertragen (nicht umdrehen). Bei 44±0,5°C für 2 Stunden inkubieren. Sofort nach Inkubation ablesen.
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Ablesung bestätigter Kolonien
Kolonien mit braun-schwarzer Zone zählen (Äsculin-Hydrolyse). Diese Kolonien = bestätigte intestinale Enterokokken.
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Ergebnisberechnung
Ergebnis = Anzahl bestätigter Kolonien / Probenvolumen × 100. Ergebnis in KBE/100 mL angeben.
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Qualitätskontrolle
Positivkontrolle: E. faecalis ATCC 29212 Stamm. Negativkontrolle: steriles Wasser. Medienkontrolle: Sterilität und Reinheit.
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Entsorgung
Alle Platten mit Kolonien autoklavieren (121°C/30 min) vor Entsorgung als infektiöser Abfall.
Erforderliche Geräte und Apparatur
| Gerät | Beispiel | Richtpreis |
|---|---|---|
| Membranfiltrationsanlage | Sartorius Combisart, Merck EZ-Fit, Pall MicroFunnel | 3 000–12 000 PLN |
| Vakuumpumpe | KNF Laboport N 810, Sartorius 16612 | 3 000–8 000 PLN |
| Brutschrank 36°C | Binder BD 56, Memmert IN30, Pol-Eko CLN 32 | 5 000–15 000 PLN |
| Brutschrank 44°C (Präzision) | Binder BD 23 mit ±0,5°C Regelung, Memmert IN30plus | 6 000–18 000 PLN |
| Autoklav zur Sterilisation | Tuttnauer ELV 2540, Systec VX-40 | 20 000–45 000 PLN |
| Lupe / Kolonienzähler | Stuart SC6+, Interscience Scan 500 | 1 500–25 000 PLN |
| Laminar-Flow-Werkbank | Esco Airstream, Telstar Bio II Advance | 15 000–40 000 PLN |
Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien
| Reagenz | CAS | Details |
|---|---|---|
| Slanetz-Bartley-Agar | — | Selektivmedium mit Natriumazid und TTC zur vorläufigen Isolierung von Enterokokken. Hersteller: Merck, Oxoid, Biokar |
| Galle-Äsculin-Azid-Agar (BEA) | — | Bestätigungsmedium mit Rindergalle, Äsculin, Eisenammoniumcitrat und Natriumazid |
| Membranfilter 0,45 µm | — | Mischcellulose-Ester (MCE), 47 mm Durchmesser, steril. Merck Millipore, Sartorius |
| 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) | 298-96-4 | Supplement zum Slanetz-Bartley-Medium, Konzentration 0,1 g/L |
| Natriumazid (NaN₃) | 26628-22-8 | Hemmstoff im Medium, hemmt gramnegative Bakterien. WARNUNG: hochgiftig! |
| Natriumthiosulfat (Na₂S₂O₃) | 7772-98-7 | Zur Neutralisierung von Chlor in Leitungswasserproben |
| Ringerlösung (1/4 Stärke) | — | Zur Verdünnung von Proben, sterile 9-mL-Röhrchen |
Arbeitsschutz und Sicherheit
- Natriumazid (NaN₃) — hochgiftig (H300, H310, H330)! Letale Dosis: 10 mg/kg. Im Abzug arbeiten, Handschuhe, Schutzbrille
- Enterokokken können Krankenhausinfektionen verursachen (VRE) — vollständige persönliche Schutzausrüstung
- Biologisches Material nach Inkubation — vor Entsorgung autoklavieren 121°C/30 min
- Arbeit mit Bunsenbrenner — Verbrennungsgefahr
- Meerwasser/Badewasser — mögliches Vorhandensein anderer Krankheitserreger, besondere Vorsicht walten lassen
Häufige Fragen
Welche Norm beschreibt diese Prüfung?
Die Prüfung erfolgt nach PN-EN ISO 7899-2:2004 — „Water quality — Detection and enumeration of intestinal enterococci — Part 2: Membrane filtration method“.
Wie funktioniert diese Methode?
Die Wasserprobe wird durch eine 0,45-µm-Membran filtriert, die Bakterien zurückhält. Die Membran wird auf Slanetz-Bartley-Medium aufgelegt und bei 36±1°C für 40–48 h inkubiert.
Wie groß sind Messbereich und Genauigkeit?
Ergebnis: KBE/100 mL (koloniebildende Einheiten); Zulässiger Wert (Trinkwasser): 0 KBE/100 mL; Isolierungstemperatur: 36 ± 1°C (vorläufige Stufe); Bestätigungstemperatur: 44 ± 0,5°C (Bestätigungsstufe).
Wie lange dauert die Prüfung?
Die für die einzelnen Schritte angegebenen Zeiten ergeben zusammen rund 1 Tage 19 Std. 37 Min.–2 Tage 3 Std. 37 Min. Das Verfahren umfasst 10 Schritte.
Welche Geräte werden benötigt?
Membranfiltrationsanlage, Vakuumpumpe, Brutschrank 36°C, Brutschrank 44°C (Präzision), Autoklav zur Sterilisation, Lupe / Kolonienzähler, Laminar-Flow-Werkbank. Richtpreis für das Kerngerät (Membranfiltrationsanlage): 3 000–12 000 PLN.
Wo wird diese Prüfung eingesetzt?
Kontrolle der Trinkwasserqualität (Gesetzblatt 2017 — Enterokokken: 0 KBE/100 mL); Überwachung von Badegewässern (Richtlinie 2006/7/EG); Untersuchung von Flaschen- und Quellwasser; Bewertung der Wirksamkeit der Wasserdesinfektion (Chlorierung, UV, Ozonung); Überwachung von Meerwasser und Brackwasser — bessere Überlebensfähigkeit als E. coli; Untersuchung von Grundwasser und Infiltrationsanlagen; Kontrolle der Schwimmbadwasserqualität.
Welche Sicherheitsmaßnahmen gelten?
Natriumazid (NaN₃) — hochgiftig (H300, H310, H330)! Letale Dosis: 10 mg/kg. Im Abzug arbeiten, Handschuhe, Schutzbrille; Enterokokken können Krankenhausinfektionen verursachen (VRE) — vollständige persönliche Schutzausrüstung; Biologisches Material nach Inkubation — vor Entsorgung autoklavieren 121°C/30 min; Arbeit mit Bunsenbrenner — Verbrennungsgefahr; Meerwasser/Badewasser — mögliches Vorhandensein anderer Krankheitserreger, besondere Vorsicht walten lassen.
Welches Labor führt diese Prüfung durch?
Die Prüfung führen nach ISO/IEC 17025 akkreditierte Labore durch. Auf LabCoda finden Sie sie über die Normnummer PN-EN ISO 7899-2.