🦠 Enterobacteriaceae in Lebensmitteln und Futtermitteln — Nachweis mit Anreicherung in BPW und Isolierung auf VRBG-Agar

Mikrobiologie PN-EN ISO 21528-1

Übersicht

ISO 21528-1:2017 legt ein Verfahren mit Anreicherung zum Nachweis von Enterobacteriaceae fest. Es wird auf Erzeugnisse angewendet, die zum Verzehr durch den Menschen und zur Fütterung von Tieren bestimmt sind, sowie auf Umgebungsproben aus dem Bereich der Primärproduktion, der Herstellung und des Verkehrs mit Lebensmitteln. Das Verfahren ist dann geeignet, wenn die gesuchten Mikroorganismen voraussichtlich einer Wiederbelebung durch Anreicherung bedürfen und wenn ihre erwartete Zahl unter 100 je Milliliter oder Gramm der Probe liegt. Eine Einschränkung ist die Anfälligkeit des Verfahrens für eine große Streuung (Abschnitt 11 der Norm). Die Zahlbestimmung kann nach dem Verfahren der wahrscheinlichsten Keimzahl (MPN) nach der Bebrütung in einem flüssigen Nährmedium ausgeführt werden (Anhang A). Die Norm wurde für Einwaagen von 10 g oder 10 ml validiert.

Die Temperatur von 37 °C für die Anreicherung und die Isolierung wird angewendet, wenn die Enterobacteriaceae als Hygieneindikator untersucht werden; 30 °C wählt man für technologische Zwecke, wenn auch psychrotrophe Enterobacteriaceae erfasst werden müssen. Für die Zahlbestimmung der Enterobacteriaceae nach dem Koloniezählverfahren dient Teil 2 der Norm (ISO 21528-2) — diesen nennt die Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 als Referenzverfahren in den Prozesshygienekriterien (u. a. Schlachtkörper nach dem Ausweiden). In Polen gilt Teil 1 als PN-EN ISO 21528-1:2017-08; die frühere PN-ISO 21528-1:2005 betraf den Nachweis und die Zahlbestimmung nach dem MPN-Verfahren mit Voranreicherung. In der Lehre der Lebensmittelmikrobiologie (UWM, Universität Ermland-Masuren in Olsztyn) wird dasselbe Schema — gepuffertes Peptonwasser 37 °C/18 h, Isolierung auf VRBG 37 °C/24 h, dunkelrote Kolonien, Bestätigung mit der Oxidase (kein Farbumschlag in 10 s) und der Glucosevergärung — als der übliche Weg zum Nachweis der Stäbchen dieser Familie beschrieben.

Prinzip der Methode

Gepuffertes Peptonwasser (BPW) wird mit der Einwaage beimpft und 18 h bei 37 °C (oder 30 °C) bebrütet; typischerweise werden 10 g der Probe mit 90 ml BPW vermischt, wodurch eine Zehnfachverdünnung entsteht. Nach der Anreicherung wird die Kultur mit der Impföse auf die Oberfläche eines Agars mit Kristallviolett, Neutralrot, Galle und Glucose (VRBG) ausgestrichen und bei 37 °C bebrütet; die Platten werden nach 24 h auf typische Kolonien präsumtiver Enterobacteriaceae durchgesehen — rosa bis rote oder purpurne Kolonien, mit oder ohne Hof aus ausgefällter Galle. Ausgewählte Kolonien (mindestens eine typische oder verdächtige, bei negativem Ergebnis bis zu vier weitere; je eine von jeder Morphologie) werden auf ein nichtselektives Nährmedium (z. B. Nähragar, 37 °C, 24 h ± 2 h) überimpft und mit zwei Tests bestätigt: mit der Oxidase-Reaktion (mit dem Oxidase-Reagenz getränktes Filterpapier oder gebrauchsfertige Plättchen; der Test ist negativ, wenn innerhalb von 10 s keine dunkelblauviolette Färbung auftritt; mit einer Platin-Iridium-Impföse, niemals mit einer Nickel-Chrom-Impföse) sowie mit dem Test auf Glucosevergärung — oxidasenegative Kolonien werden in das OF-Nährmedium mit Glucose eingestochen, mit mindestens 1 cm sterilem Mineralöl überschichtet und 24 h ± 2 h bei 37 °C bebrütet; eine Gelbfärbung des gesamten Röhrcheninhalts bedeutet eine positive Reaktion. Manche Enterobacteriaceae entfärben die Kolonien oder das Nährmedium, deshalb werden bei Fehlen charakteristischer Kolonien weißliche Kolonien für die Bestätigungen ausgewählt. Das Ergebnis wird als Enterobacteriaceae nachgewiesen oder nicht nachgewiesen in der Einwaage von x g oder x ml des Erzeugnisses oder auf der abgestrichenen Fläche angegeben.

Anwendungen

• Lebensmittel und Futtermittel, in denen die erwartete Zahl der Enterobacteriaceae unter 100/g oder 100/ml liegt oder die Zellen einer Wiederbelebung bedürfen (hitzebehandelte, getrocknete, gefrorene Erzeugnisse)
• Umgebungsproben aus der Primärproduktion, aus Herstellungsbetrieben und dem Verkehr mit Lebensmitteln (Abstriche von Oberflächen, von Geräten)
• Indikator der Prozesshygiene — Anreicherung und Isolierung bei 37 °C
• Technologische Zwecke unter Berücksichtigung psychrotropher Enterobacteriaceae — Variante bei 30 °C
• Halbquantitativ: MPN-Bestimmung nach der Bebrütung in einem flüssigen Nährmedium (Anhang A der Norm)

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 21528-1:2017-08 (ISO 21528-1:2017)

Titel (PL)

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Enterobacteriaceae — Część 1: Wykrywanie Enterobacteriaceae

Title (EN)

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae — Part 1: Detection of Enterobacteriaceae

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Einwaage und Erstverdünnung

   Wiege die Einwaage ein (die Norm ist für 10 g oder 10 ml validiert) und vermische sie mit dem neunfachen Volumen BPW (z. B. 10 g + 90 ml), wodurch eine Zehnfachverdünnung entsteht; kleinere Einwaagen sind nach der Norm zulässig.

2. Anreicherung

   Bebrüte die Erstverdünnung 18 h ± 2 h bei 37 °C (oder bei 30 °C für technologische Zwecke).

3. Isolierung auf VRBG

   Streiche mit der Impföse aus der angereicherten Kultur die Oberfläche einer Platte mit VRBG-Agar aus und bebrüte sie 24 h ± 2 h bei 37 °C.

4. Auswahl der Kolonien

   Markiere die verdächtigen Kolonien (rosa bis rot oder purpurn, mit oder ohne Hof aus ausgefällter Galle). Wähle mindestens eine typische Kolonie; fällt die Bestätigung negativ aus — bis zu vier weitere. Bei mehreren Morphologien — je eine von jeder; bei Fehlen charakteristischer Kolonien — weißliche Kolonien.

5. Überimpfung

   Impfe jede ausgewählte Kolonie auf ein nichtselektives Nährmedium (z. B. Nähragar) und bebrüte 24 h ± 2 h bei 37 °C; nimm für die Tests eine gut isolierte Kolonie.

6. Oxidase-Test

   Verreibe mit einer Platin-Iridium-Impföse, einem Draht oder einem Glasstab einen Teil der Kolonie auf einem mit dem Oxidase-Reagenz getränkten Filterpapier (oder auf einem handelsüblichen Plättchen). Die Reaktion ist negativ, wenn sich das Papier innerhalb von 10 s nicht dunkelblauviolett färbt.

7. Test auf Glucosevergärung

   Steche oxidasenegative Kolonien mit einem Draht in Röhrchen mit dem OF-Nährmedium mit Glucose ein, überschichte sie mit mindestens 1 cm sterilem Mineralöl und bebrüte 24 h ± 2 h bei 37 °C. Eine Gelbfärbung des gesamten Röhrcheninhalts = positive Reaktion.

8. Ergebnis

   Betrachte oxidasenegative und Glucose vergärende Kolonien als Enterobacteriaceae. Gib an: nachgewiesen / nicht nachgewiesen in der Einwaage von x g oder x ml des Erzeugnisses oder auf der abgestrichenen Fläche.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Zu den Enterobacteriaceae gehören Darmpathogene (Salmonella, pathogene E. coli) — Arbeit unter den Bedingungen eines mikrobiologischen Labors, Desinfektion und Autoklavieren der verbrauchten Kulturen
• Mineralöl und Oxidase-Reagenz — Kontakt mit Haut und Augen vermeiden
• Agarmedien bei 47–50 °C — Verbrennungsgefahr beim Ausgießen

Häufige Fragen