🦠 Enterobacteriaceae in Lebensmitteln
Bestimmung von Enterobacteriaceae in Lebensmitteln mittels Gussplattenverfahren auf VRBG-Agar (Violet Red Bile Glucose) mit Überschichtung, Inkubation bei 37°C für 24 h.
Übersicht
Enterobacteriaceae ist eine große Familie gramnegativer Bakterien, die viele Gattungen von sanitärer und pathogener Bedeutung umfasst — Escherichia, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Proteus, Serratia, Cronobacter und andere. Sie sind ein anerkannter Indikator für den allgemeinen Hygienestatus der Lebensmittelproduktion und ergänzen die E. coli-Bestimmung (Indikator für fäkale Kontamination).
Die Norm PN-EN ISO 21528-2 beschreibt ein horizontales Verfahren zur Bestimmung von Enterobacteriaceae in Lebensmitteln und Umweltproben. Die Methode verwendet VRBG-Medium (Violet Red Bile Glucose Agar) — ein selektiv-differenzierendes Medium, in dem Kristallviolett und Gallensalze das Wachstum grampositiver Bakterien und anderer Nicht-Enterobacteriaceae-Organismen hemmen. Glucose ersetzt Lactose (in VRBL verwendet), wodurch das Medium alle Enterobacteriaceae-Mitglieder nachweisen kann, nicht nur coliforme Bakterien.
Enterobacteriaceae-Kolonien auf VRBG sind rot bis dunkelviolett, umgeben von Gallensalz-Präzipitationszone. Das Gussplattenverfahren mit zusätzlicher Überschichtungsagarschicht gewährleistet nahezu anaerobe Bedingungen, hemmt das Wachstum nicht fermentierender gramnegativer Bakterien und fördert Glucose-Fermentation.
Die Methode wird als Hygieneindikator in der Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 verwendet, einschließlich für Milchpulver, Säuglingsnahrung und verzehrfertige Produkte. Sie ist besonders wichtig in der Molkereiindustrie, wo Enterobacteriaceae auf potenzielle Nachpasteurisierungskontamination hinweisen.
Prinzip der Methode
Die Probe wird auf VRBG-Medium gegossen. Gallensalze und Kristallviolett hemmen grampositive Bakterien. Enterobacteriaceae fermentieren Glucose zu Säuren, die mit Neutralrot die Kolonien rot-violett färben. Säure verursacht auch Gallensalz-Präzipitation um Kolonien (Halo). Nach dem Gießen wird eine zusätzliche VRBG-Agarschicht (Overlay) aufgetragen, die den Sauerstoffzugang begrenzt und das Wachstum aerober nicht fermentierender Bakterien hemmt. Inkubation bei 37°C für 24 h.
Anwendungen
- Hygieneindikator für Lebensmittelproduktion — Verordnung (EG) Nr. 2073/2005
- Milchpulver- und Säuglingsformel-Qualitätskontrolle
- Nachpasteurisierungskontaminations-Überwachung
- Verzehrfertige (RTE) Produktuntersuchung
- Fleisch- und Fleischprodukt-Qualitätskontrolle
- Umweltüberwachung von Produktionsanlagen (Oberflächen, Wasser)
- Überprüfung der Wasch- und Desinfektionswirksamkeit von Produktionslinien
Schlüsselparameter
| Parameter | Wert |
|---|---|
| Inkubationstemperatur | 37 ± 1°C |
| Inkubationszeit | 24 ± 2 h |
| Medium | VRBG Agar (Violet Red Bile Glucose Agar) |
| Kolonietyp | Rot bis dunkelviolett, mit Gallensalz-Präzipitationshalo |
| Plattierungsmethode | Gussplatte mit Überschichtung |
| Bestätigung | Oxidase-Test (negativ) + Glucose-Fermentationstest (positiv) |
Norm
- Normnummer
- PN-EN ISO 21528-2:2017
- Titel (PL)
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Enterobacteriaceae — Część 2: Metoda liczenia kolonii
- Title (EN)
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae — Part 2: Colony-count technique
Schritt-für-Schritt-Verfahren
1. Probenvorbereitung
Wiegen Sie 10 g Probe in einen Stomacher-Beutel, fügen Sie 90 mL BPW hinzu, homogenisieren Sie für 60–120 s. Bereiten Sie Dezimalverdünnungen vor.
2. Gussplattierung
Übertragen Sie 1 mL jeder Verdünnung auf zwei sterile Petrischalen. Gießen Sie innerhalb von 15 min ca. 10 mL VRBG-Medium auf 44–47°C abgekühlt. Mischen Sie vorsichtig durch kreisende Bewegungen. Lassen Sie erstarren.
3. Überschichtung
Nach dem Erstarren des Agars tragen Sie zusätzliche Schicht von ca. 10 mL VRBG-Medium (44–47°C) auf die Oberfläche auf. Lassen Sie erstarren. Die Überschichtung begrenzt den Sauerstoffzugang.
4. Inkubation
Drehen Sie die Platten um und inkubieren Sie bei 37 ± 1°C für 24 ± 2 h.
5. Kolonieablesung
Zählen Sie typische Kolonien — rot bis dunkelviolett, Durchmesser 0,5 mm oder größer, mit oder ohne Präzipitationshalo. Zählen Sie Platten mit 15–300 Kolonien insgesamt.
6. Bestätigung (optional)
Wählen Sie min. 5 typische Kolonien. Führen Sie Oxidase-Test durch (negatives Ergebnis = Enterobacteriaceae). Beimpfen Sie Glucose-Bouillon mit Durham-Röhrchen — inkubieren Sie 24 h bei 37°C (Ergebnis: Glucose-Fermentation + Gas).
7. Berechnungen
Berechnen Sie die Anzahl von Enterobacteriaceae als gewichteten Durchschnitt. Wenn Bestätigung durchgeführt wurde, berücksichtigen Sie den Prozentsatz bestätigter Kolonien. Ergebnis in KBE/g ausdrücken.
8. Qualitätskontrolle
Positivkontrolle: E. coli ATCC 25922 (typische Kolonien, oxidase-negativ). Negativkontrolle: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (kein Wachstum oder atypische Kolonien, oxidase-positiv). Mediumsterilitätskontrolle.
Erforderliche Geräte und Apparatur
| Gerät | Beispiel | Richtpreis |
|---|---|---|
| Laborinkubator 37°C | Binder BD 56, Memmert INB 200, POL-EKO CLN 53 | 5.000–18.000 PLN |
| Wasserbad 44–47°C | Memmert WNB 14, Julabo TW 12, POL-EKO LW-4 | 3.000–10.000 PLN |
| Laminar-Flow-Werkbank Klasse II | Thermo Scientific MSC-Advantage, ESCO Airstream | 25.000–60.000 PLN |
| Stomacher / Homogenisator | Seward Stomacher 400, Interscience BagMixer | 12.000–25.000 PLN |
| Laborautoklav | Tuttnauer 2540M, Systec VX-65 | 15.000–45.000 PLN |
| Koloniezähler | Interscience Scan 300, Stuart SC6+ | 3.000–15.000 PLN |
Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien
| Reagenz | CAS | Details |
|---|---|---|
| VRBG Agar (Violet Red Bile Glucose Agar) | 548-62-9 | Selektiv-differenzierendes Medium: Gelatinepepton, Hefeextrakt, Gallensalze, Glucose, Kristallviolett, Neutralrot, NaCl, Agar; 500 g Packung |
| Kristallviolett (Crystal Violet) | 548-62-9 | Farbstoff zur Hemmung grampositiver Bakterien; Konzentration 0,002 g/L |
| Gallensalze (Bile Salts Mixture) | — | Selektives Agens zur Hemmung grampositiver und nicht fermentierender Bakterien; 1,5 g/L |
| Neutralrot (Neutral Red) | 553-24-2 | pH-Indikator — färbt glucose-fermentierende Kolonien rot; 0,03 g/L |
| D-Glucose | 50-99-7 | Kohlenstoffquelle, von Enterobacteriaceae fermentiert; 10 g/L |
| Glucose-Bouillon (Glucose Broth) | — | Für Glucose-Fermentationstest (Bestätigung), mit Durham-Röhrchen |
| Oxidase-Reagenz (Kovács) | — | Für Oxidase-Test — Enterobacteriaceae oxidase-negativ; Streifen oder Tropfen |
| Gepuffertes Peptonwasser (BPW) | — | Für Probenverdünnungen, 500 g Packung |
Arbeitsschutz und Sicherheit
- Enterobacteriaceae-Familie umfasst Pathogene (Salmonella, E. coli) — PSA verwenden
- Arbeit in Laminar-Flow-Werkbank Klasse II obligatorisch
- Kristallviolett — färbt Haut, Handschuhe verwenden
- Gebrauchte Materialien vor Entsorgung autoklavieren (121°C/20 min)
- Oberflächendesinfektion mit 70% Ethanol oder Natriumhypochlorit