🦠 β-Glucuronidase-positive E. coli in Lebensmitteln
Bestimmung von β-Glucuronidase-positiven Escherichia coli in Lebensmitteln mittels Gussplattenverfahren auf TBX-Agar bei 44°C. E. coli-Kolonien bilden charakteristische blaugrüne Färbung.
Übersicht
Escherichia coli ist der wichtigste Indikator für fäkale Kontamination von Lebensmitteln. Das Vorhandensein von E. coli in Lebensmitteln weist auf unzureichende Produktionshygiene, unsachgemäße Wärmebehandlung oder sekundäre Kontamination nach der Pasteurisierung hin. Die Norm PN-EN ISO 16649-2 legt ein horizontales Verfahren zur Bestimmung von β-Glucuronidase-positiven E. coli fest, das die Fähigkeit dieser Bakterien zur Spaltung des chromogenen Substrats X-Gluc (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid) nutzt.
Die Methode basiert auf dem Gussplattenverfahren (Pour Plate) auf TBX-Medium (Tryptone Bile X-glucuronide Agar) und Inkubation bei 44°C für 18–24 h. Unter diesen Bedingungen bildet E. coli charakteristische blaugrüne Kolonien aufgrund der β-Glucuronidase-Enzymaktivität, die das chromogene Substrat hydrolysiert. Etwa 96–97% der E. coli-Stämme zeigen β-Glucuronidase-Aktivität, was diese Methode hochspezifisch macht.
Eine wesentliche Einschränkung der Methode besteht darin, dass E. coli O157:H7-Stämme — zu den gefährlichsten lebensmittelbedingten Krankheitserregern gehörend — überwiegend β-Glucuronidase-negativ sind und mit dieser Methode nicht nachgewiesen werden. Daher werden separate Methoden für STEC/VTEC-Nachweis verwendet (z.B. PN-EN ISO 13136). Die Methode ist auch nicht für alle E. coli-Stämme geeignet, die bei 44°C schlecht wachsen können.
Die Untersuchung ist durch polnische und EU-Lebensmittelsicherheitsvorschriften vorgeschrieben, einschließlich der Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 über mikrobiologische Kriterien für Lebensmittel. Sie findet Anwendung in der Qualitätskontrolle von Milchprodukten, Fleisch, Gemüse, Meeresfrüchten und Trinkwasser.
Prinzip der Methode
Die Methode nutzt die Fähigkeit von E. coli zur Produktion des Enzyms β-Glucuronidase (GUD), das das im TBX-Medium enthaltene chromogene Substrat 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid (X-Gluc) hydrolysiert. Die Hydrolyse setzt Indoxyl frei, das oxidiert und dimerisiert wird und einen unlöslichen blauen Farbstoff (5,5'-Dibrom-4,4'-dichlor-indigo) bildet. E. coli-Kolonien nehmen charakteristische blaugrüne Färbung an. Im Medium vorhandene Gallensalze hemmen das Wachstum grampositiver Bakterien und gewährleisten Selektivität. Die Inkubation bei 44°C schränkt zusätzlich das Wachstum von Nicht-E. coli-Organismen ein.
Anwendungen
- Mikrobiologische Qualitätskontrolle von Lebensmitteln (Fleisch, Milchprodukte, Gemüse, Meeresfrüchte)
- Einhaltung der Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 — mikrobiologische Kriterien
- Überwachung der Hygiene von Produktionsprozessen in Lebensmittelbetrieben
- Untersuchung von Trinkwasser und Wasser für die Lebensmittelproduktion
- Überprüfung der Wirksamkeit von Pasteurisierung und Wärmebehandlung
- Verifizierung von HACCP- und GHP/GMP-Systemen
- Amtliche Kontrolle durch Sanitärinspektion und Veterinärinspektion
Schlüsselparameter
| Parameter | Wert |
|---|---|
| Inkubationstemperatur | 44 ± 1°C |
| Inkubationszeit | 18–24 h |
| Medium | TBX Agar (Tryptone Bile X-glucuronide) |
| Bestimmungsbereich | 10–3 × 10⁵ KBE/g (bei Verdünnungen 10⁻¹ bis 10⁻⁴) |
| Kolonietyp | Blaugrüne Kolonien (β-Glucuronidase +) |
| Plattierungsmethode | Gussplatte (Pour Plate), 1 mL pro Platte |
Norm
- Normnummer
- PN-EN ISO 16649-2:2004
- Titel (PL)
- Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby β-glukuronidazo-dodatnich Escherichia coli — Część 2: Metoda liczenia kolonii w temperaturze 44°C z zastosowaniem 5-bromo-4-chloro-3-indolylo-β-D-glukuronidu
- Title (EN)
- Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of beta-glucuronidase-positive Escherichia coli — Part 2: Colony-count technique at 44 degrees C using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-glucuronide
Schritt-für-Schritt-Verfahren
1. Probenvorbereitung
Wiegen Sie 25 g (oder 10 g) Probe in einen Stomacher-Beutel. Fügen Sie 225 mL (oder 90 mL) gepuffertes Peptonwasser (BPW) hinzu. Homogenisieren Sie im Stomacher für 60–120 s. Sie erhalten eine 10⁻¹-Verdünnung.
2. Herstellung der Verdünnungen
Bereiten Sie eine Dezimalverdünnungsreihe (10⁻², 10⁻³, 10⁻⁴) vor, indem Sie 1 mL in 9 mL Verdünnungsmittel überführen. Verwenden Sie für jede Verdünnung eine neue Pipette.
3. Gussplattierung
Übertragen Sie je 1 mL jeder Verdünnung auf zwei sterile Petrischalen (Duplikate). Gießen Sie innerhalb von 15 min ca. 15 mL TBX-Medium auf 44–47°C abgekühlt.
4. Mischen und Erstarren
Mischen Sie das Inokulum vorsichtig mit dem Medium durch kreisende und schaukelnde Bewegungen. Lassen Sie die Platten auf horizontaler Fläche bis zum Erstarren des Agars (ca. 10–15 min).
5. Resuscitation (optional)
Wenn Sie geschädigte Zellen vermuten (z.B. Tiefkühlproben), inkubieren Sie die Platten 4 h bei 37°C, bevor Sie sie auf 44°C übertragen, um Resuscitation zu ermöglichen.
6. Inkubation
Drehen Sie die Platten um (Boden nach oben) und inkubieren Sie bei 44 ± 1°C für 18–24 h.
7. Ablesen der Ergebnisse
Zählen Sie blaugrüne Kolonien, typisch für β-Glucuronidase-positive E. coli. Zählen Sie Platten mit 15–300 Kolonien insgesamt (typische und atypische).
8. Berechnungen
Berechnen Sie die E. coli-Zahl als gewichteten Durchschnitt aus zwei aufeinanderfolgenden Verdünnungen nach Formel: N = ΣC / (V × 1,1 × d), wobei ΣC — Summe der Kolonien, V — Aussaatvolumen, d — Verdünnung. Ergebnis in KBE/g oder KBE/mL ausdrücken.
9. Qualitätskontrolle
Führen Sie parallel Negativkontrolle (Medium ohne Aussaat) und Positivkontrolle (Referenzstamm E. coli ATCC 25922) durch. Prüfen Sie die Sterilität des Peptonwassers.
10. Dokumentation und Berichterstattung
Erfassen Sie die Ergebnisse im Laborjournal, fügen Sie Probenidentifikation, Chargennummern der Medien, Inkubationstemperatur und Berechnungen bei. Berichten Sie das Ergebnis als KBE/g mit Angabe der Messunsicherheit.
Erforderliche Geräte und Apparatur
| Gerät | Beispiel | Richtpreis |
|---|---|---|
| Laborinkubator 44°C | Binder BD 56/115, Memmert INB 200, POL-EKO CLN 53 | 5.000–18.000 PLN |
| Wasserbad 44–47°C | Memmert WNB 14, Julabo TW 12, POL-EKO LW-4 | 3.000–10.000 PLN |
| Laminar-Flow-Werkbank Klasse II | Thermo Scientific MSC-Advantage, ESCO Airstream | 25.000–60.000 PLN |
| Laborautoklav | Tuttnauer 2540M, Systec VX-65, SMS Prestige Medical | 15.000–45.000 PLN |
| Stomacher / Homogenisator | Seward Stomacher 400 Circulator, BagMixer 400 | 12.000–25.000 PLN |
| Koloniezähler | Interscience Scan 300, BZG Colony Star, Stuart SC6+ | 3.000–15.000 PLN |
| Automatische Pipetten 1 mL | Eppendorf Research Plus, Gilson Pipetman, HTL Discovery Comfort | 400–1.200 PLN |
Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien
| Reagenz | CAS | Details |
|---|---|---|
| TBX Agar (Tryptone Bile X-glucuronide Agar) | 114162-64-0 | Chromogenes Medium mit Trypton, Gallensalzen und X-Gluc; fertige Beutel oder Platten, 500 g / 20 Platten Packung |
| 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid (X-Gluc) | 114162-64-0 | Chromogenes Substrat für β-Glucuronidase, TBX-Komponente, 1–5 g Packung |
| Trypton (Kaseinpepton) | 91079-40-2 | Stickstoff- und Aminosäurequelle im TBX-Medium |
| Gallensalze (Bile Salts No. 3) | — | Selektives Agens zur Hemmung grampositiver Bakterien, Konzentration 1,5 g/L |
| Gepuffertes Peptonwasser (BPW) | — | Zur Herstellung von Dezimalverdünnungen der Probe, 500 g Packung |
| Bakteriologischer Agar | 9002-18-0 | Geliermittel, 500 g Packung |
Arbeitsschutz und Sicherheit
- Arbeit mit potenziell infektiösem Material — Einweghandschuhe, Laborkittel und Schutzbrille verwenden
- Alle Tätigkeiten mit offener Probe in Laminar-Flow-Werkbank Klasse II durchführen
- Gebrauchte Medien und Proben autoklavieren (121°C, 15 min) vor Entsorgung
- Arbeitsflächen mit 70% Ethanol oder chlorhaltigem Präparat desinfizieren
- Aseptische Grundsätze befolgen — Infektionsrisiko mit enteropathogenen E. coli