🦠 β-Glucuronidase-positive E. coli in Lebensmitteln

Mikrobiologie PN-EN ISO 16649-2

Übersicht

Escherichia coli ist der wichtigste Indikator für fäkale Kontamination von Lebensmitteln. Das Vorhandensein von E. coli in Lebensmitteln weist auf unzureichende Produktionshygiene, unsachgemäße Wärmebehandlung oder sekundäre Kontamination nach der Pasteurisierung hin. Die Norm PN-EN ISO 16649-2 legt ein horizontales Verfahren zur Bestimmung von β-Glucuronidase-positiven E. coli fest, das die Fähigkeit dieser Bakterien zur Spaltung des chromogenen Substrats X-Gluc (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid) nutzt.

Die Methode basiert auf dem Gussplattenverfahren (Pour Plate) auf TBX-Medium (Tryptone Bile X-glucuronide Agar) und Inkubation bei 44°C für 18–24 h. Unter diesen Bedingungen bildet E. coli charakteristische blaugrüne Kolonien aufgrund der β-Glucuronidase-Enzymaktivität, die das chromogene Substrat hydrolysiert. Etwa 96–97% der E. coli-Stämme zeigen β-Glucuronidase-Aktivität, was diese Methode hochspezifisch macht.

Eine wesentliche Einschränkung der Methode besteht darin, dass E. coli O157:H7-Stämme — zu den gefährlichsten lebensmittelbedingten Krankheitserregern gehörend — überwiegend β-Glucuronidase-negativ sind und mit dieser Methode nicht nachgewiesen werden. Daher werden separate Methoden für STEC/VTEC-Nachweis verwendet (z.B. PN-EN ISO 13136). Die Methode ist auch nicht für alle E. coli-Stämme geeignet, die bei 44°C schlecht wachsen können.

Die Untersuchung ist durch polnische und EU-Lebensmittelsicherheitsvorschriften vorgeschrieben, einschließlich der Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 über mikrobiologische Kriterien für Lebensmittel. Sie findet Anwendung in der Qualitätskontrolle von Milchprodukten, Fleisch, Gemüse, Meeresfrüchten und Trinkwasser.

Prinzip der Methode

Die Methode nutzt die Fähigkeit von E. coli zur Produktion des Enzyms β-Glucuronidase (GUD), das das im TBX-Medium enthaltene chromogene Substrat 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid (X-Gluc) hydrolysiert. Die Hydrolyse setzt Indoxyl frei, das oxidiert und dimerisiert wird und einen unlöslichen blauen Farbstoff (5,5'-Dibrom-4,4'-dichlor-indigo) bildet. E. coli-Kolonien nehmen charakteristische blaugrüne Färbung an. Im Medium vorhandene Gallensalze hemmen das Wachstum grampositiver Bakterien und gewährleisten Selektivität. Die Inkubation bei 44°C schränkt zusätzlich das Wachstum von Nicht-E. coli-Organismen ein.

Anwendungen

• Mikrobiologische Qualitätskontrolle von Lebensmitteln (Fleisch, Milchprodukte, Gemüse, Meeresfrüchte)
• Einhaltung der Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 — mikrobiologische Kriterien
• Überwachung der Hygiene von Produktionsprozessen in Lebensmittelbetrieben
• Untersuchung von Trinkwasser und Wasser für die Lebensmittelproduktion
• Überprüfung der Wirksamkeit von Pasteurisierung und Wärmebehandlung
• Verifizierung von HACCP- und GHP/GMP-Systemen
• Amtliche Kontrolle durch Sanitärinspektion und Veterinärinspektion

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 16649-2:2004

Titel (PL)

Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby β-glukuronidazo-dodatnich Escherichia coli — Część 2: Metoda liczenia kolonii w temperaturze 44°C z zastosowaniem 5-bromo-4-chloro-3-indolylo-β-D-glukuronidu

Title (EN)

Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of beta-glucuronidase-positive Escherichia coli — Part 2: Colony-count technique at 44 degrees C using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-glucuronide

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Probenvorbereitung

   Wiegen Sie 25 g (oder 10 g) Probe in einen Stomacher-Beutel. Fügen Sie 225 mL (oder 90 mL) gepuffertes Peptonwasser (BPW) hinzu. Homogenisieren Sie im Stomacher für 60–120 s. Sie erhalten eine 10⁻¹-Verdünnung.

   ⏱ Zeit: 5 min

2. Herstellung der Verdünnungen

   Bereiten Sie eine Dezimalverdünnungsreihe (10⁻², 10⁻³, 10⁻⁴) vor, indem Sie 1 mL in 9 mL Verdünnungsmittel überführen. Verwenden Sie für jede Verdünnung eine neue Pipette.

   ⏱ Zeit: 5 min

3. Gussplattierung

   Übertragen Sie je 1 mL jeder Verdünnung auf zwei sterile Petrischalen (Duplikate). Gießen Sie innerhalb von 15 min ca. 15 mL TBX-Medium auf 44–47°C abgekühlt.

   ⏱ Zeit: 10 min • 🌡 Temperatur: 44–47°C

4. Mischen und Erstarren

   Mischen Sie das Inokulum vorsichtig mit dem Medium durch kreisende und schaukelnde Bewegungen. Lassen Sie die Platten auf horizontaler Fläche bis zum Erstarren des Agars (ca. 10–15 min).

   ⏱ Zeit: 15 min

5. Resuscitation (optional)

   Wenn Sie geschädigte Zellen vermuten (z.B. Tiefkühlproben), inkubieren Sie die Platten 4 h bei 37°C, bevor Sie sie auf 44°C übertragen, um Resuscitation zu ermöglichen.

   ⏱ Zeit: 4 h • 🌡 Temperatur: 37°C

6. Inkubation

   Drehen Sie die Platten um (Boden nach oben) und inkubieren Sie bei 44 ± 1°C für 18–24 h.

   ⏱ Zeit: 18–24 h • 🌡 Temperatur: 44°C

7. Ablesen der Ergebnisse

   Zählen Sie blaugrüne Kolonien, typisch für β-Glucuronidase-positive E. coli. Zählen Sie Platten mit 15–300 Kolonien insgesamt (typische und atypische).

   ⏱ Zeit: 15 min

8. Berechnungen

   Berechnen Sie die E. coli-Zahl als gewichteten Durchschnitt aus zwei aufeinanderfolgenden Verdünnungen nach Formel: N = ΣC / (V × 1,1 × d), wobei ΣC — Summe der Kolonien, V — Aussaatvolumen, d — Verdünnung. Ergebnis in KBE/g oder KBE/mL ausdrücken.

9. Qualitätskontrolle

   Führen Sie parallel Negativkontrolle (Medium ohne Aussaat) und Positivkontrolle (Referenzstamm E. coli ATCC 25922) durch. Prüfen Sie die Sterilität des Peptonwassers.

10. Dokumentation und Berichterstattung

    Erfassen Sie die Ergebnisse im Laborjournal, fügen Sie Probenidentifikation, Chargennummern der Medien, Inkubationstemperatur und Berechnungen bei. Berichten Sie das Ergebnis als KBE/g mit Angabe der Messunsicherheit.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Arbeit mit potenziell infektiösem Material — Einweghandschuhe, Laborkittel und Schutzbrille verwenden
• Alle Tätigkeiten mit offener Probe in Laminar-Flow-Werkbank Klasse II durchführen
• Gebrauchte Medien und Proben autoklavieren (121°C, 15 min) vor Entsorgung
• Arbeitsflächen mit 70% Ethanol oder chlorhaltigem Präparat desinfizieren
• Aseptische Grundsätze befolgen — Infektionsrisiko mit enteropathogenen E. coli

Häufige Fragen