🦠 E. coli in Oberflächenwässern und Abwasser — miniaturisiertes MPN-Verfahren auf Mikrotiterplatten (MUG)

Mikrobiologie PN-EN ISO 9308-3

Übersicht

ISO 9308-3:1998 legt ein miniaturisiertes Verfahren zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Escherichia coli in Oberflächenwässern und Abwasser durch das Beimpfen eines flüssigen Nährmediums fest; es wird für alle Arten von Oberflächenwässern und Abwässern angewendet, besonders für schwebstoffreiche. Es eignet sich nicht für Trinkwasser und andere Wässer, für die der Richtwert niedriger als 15 Bakterien/100 ml ist, und es dient nicht dem Nachweis anderer coliformer Bakterien als E. coli. E. coli wird als ein β-D-glucuronidasepositiver Mikroorganismus definiert, der bei 44 °C in einem flüssigen Nährmedium mit 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid (MUG) wächst. Das Verfahren wurde in Ringversuchen validiert (Anhang D). In der Europäischen Union weist die Richtlinie 2006/7/EG über die Qualität der Badegewässer und deren Bewirtschaftung ISO 9308-3 oder ISO 9308-1 als Referenzverfahren für die Bestimmung von E. coli (KBE/100 ml) in Binnengewässern sowie in Küsten- und Übergangsgewässern aus. In Polen gilt sie als PN-EN ISO 9308-3:2002.

Prinzip der Methode

Die verdünnte Probe wird in eine Reihe von Vertiefungen einer Mikrotiterplatte eingeimpft, die ein dehydratisiertes Kulturnährmedium enthalten. Nach einer Bebrütung von mindestens 36 h und höchstens 72 h bei (44 ± 0,5) °C werden die Platten im Dunkeln im UV-Licht bei 366 nm betrachtet — die Anwesenheit von E. coli zeigt eine blaue Fluoreszenz an, die aus der Hydrolyse des MUG entsteht; das Ergebnis wird als wahrscheinlichste Keimzahl (MPN) je 100 ml angegeben. Das MUG/EC-Nährmedium enthält Tryptose 40 g, Salicin 1 g, Triton X-100 1 g und MUG 100 mg je 1000 ml (das MUG in 2 ml N,N-Dimethylformamid gelöst), pH 6,9 ± 0,2, sterilisiert durch Filtration bei 0,2 µm, zu je 100 µl in die Vertiefungen von 96er-Platten (Fassungsvermögen ≥ 350 µl) gefüllt und sofort im Tunneltrockner oder in der Laminar-Box dehydratisiert; seine Herstellung muss die Qualitätskriterien des Anhangs E erfüllen. Das spezielle Verdünnungsmittel (SD) besteht aus 22,5 g synthetischem Meersalz je 1000 ml Wasser (wahlweise mit Bromphenolblau zur Unterscheidung von Wasser) und wird 15–20 min bei (121 ± 3) °C sterilisiert; für Meerwasser (Salzgehalt > 30 g/kg) wird die erste Verdünnung in demineralisiertem Wasser hergestellt. Die Zahl der Verdünnungen und der Vertiefungen richtet sich nach der erwarteten Verunreinigung: Badegewässer — 2 Verdünnungen (64 Vertiefungen 1/2 und 32 Vertiefungen 1/20; Bereich 15–3,5·10⁴/100 ml), frische Oberflächenwässer — 4 Verdünnungen zu je 24 Vertiefungen (40–3,2·10⁶), Abwasser und Kläranlagen — 6 Verdünnungen zu je 16 Vertiefungen (60–6,7·10⁸). Aus der Zahl der positiven Vertiefungen in jeder Verdünnung wird die Kennzahl gebildet, und die MPN sowie das 95-%-Vertrauensintervall werden mit dem Programm aus Anhang A oder B berechnet (Poisson-Verteilung); bei keiner positiven Vertiefung wird das Ergebnis als „< n/100 ml" angegeben.

Anwendungen

• Überwachung der Qualität der Badegewässer — Referenzverfahren für E. coli nach der Richtlinie 2006/7/EG (Binnengewässer, Küsten- und Übergangsgewässer)
• Schwebstoffreiche Oberflächenwässer (Flüsse, Seen), in denen die Membranfiltration unbrauchbar ist
• Rohes und gereinigtes Abwasser, Abläufe von Kläranlagen (Bereich bis 6,7·10⁸/100 ml)
• Meer- und Brackwässer — dank des Verdünnungsmittels mit Meersalz
• Große Serienuntersuchungen — Format der 96er-Platten und Mehrkanalpipetten

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 9308-3:2002 (ISO 9308-3:1998 + Cor 1:2000)

Titel (PL)

Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Escherichia coli i bakterii grupy coli — Część 3: Zminiaturyzowana metoda wykrywania i oznaczania E. coli w wodach powierzchniowych i w ściekach (najbardziej prawdopodobna liczba bakterii)

Title (EN)

Water quality — Detection and enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria in surface and waste water — Part 3: Miniaturized method (Most Probable Number) by inoculation in liquid medium

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Probenahme

   Nimm die Proben nach ISO 8199 sowie ISO 5667-1, -2 und -3 und liefere sie ein.

2. Wahl der Verdünnungen

   Wähle die Zahl der Verdünnungen und der Vertiefungen nach der erwarteten Verunreinigung (Tabelle 1 der Norm): Badegewässer — 64 Vertiefungen 1/2 und 32 Vertiefungen 1/20; Oberflächenwässer — 4 Verdünnungen zu je 24 Vertiefungen; Abwasser — bis 6 Verdünnungen zu je 16 Vertiefungen.

3. Verdünnungen

   Gib in die Röhrchen je 9 ml des Verdünnungsmittels SD (für Meerwasser mit einem Salzgehalt > 30 g/kg — das erste Röhrchen mit 9 ml demineralisiertem Wasser). Mische die Probe kräftig und überführe 9 ml in das erste Röhrchen (1/2), danach 1 ml in das nächste (1/20), weiter je 1 ml (1/200 usw.), wobei du die Pipetten wechselst. Arbeite in der Sicherheitswerkbank (Aerosole).

4. Beimpfen der Platten

   Gieße den Inhalt des Röhrchens in eine sterile Petrischale von 90 mm und verteile mit der 8-Kanal-Pipette je 200 µl auf die Vertiefungen, die der jeweiligen Verdünnung entsprechen; wechsle für die folgenden Verdünnungen die Petrischale und die Spitzen. Achte auf ein Überlaufen zwischen den Vertiefungen.

5. Bebrütung

   Verklebe die Platte mit einer sterilen selbstklebenden Folie und bebrüte sie bei (44 ± 0,5) °C über 36–72 h, ohne die Platten zu neigen.

6. Ablesung

   Lege die Platte mit der Folie in die UV-Kammer; erkenne alle Vertiefungen mit blauer Fluoreszenz als positiv an (die Ablesung ist zu einem beliebigen Zeitpunkt nach 36 h möglich).

7. Berechnungen

   Notiere für jede Verdünnung die Zahl der positiven Vertiefungen als Kennzahl (bei ≥ 3 Verdünnungen — dreistellig, die letzte nach Möglichkeit 0, nach ISO 8199); berechne die MPN je ml und das 95-%-Vertrauensintervall mit dem Programm aus Anhang A oder B und rechne auf 100 ml um (z. B. 32/5 → 756/100 ml, 542–1054); gib ohne positive Vertiefungen „< n/100 ml" an.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• N,N-Dimethylformamid ist giftig und kann Krebs erzeugen; gesundheitsschädlich beim Einatmen, bei Hautkontakt und beim Verschlucken — Arbeit unter dem Chemieabzug
• UV-Strahlung reizt Augen und Haut — Schutzbrille und Schutzhandschuhe beim Ablesen
• Das Verdünnen und Pipettieren von Abwasser erzeugt Aerosole — Sicherheitswerkbank

Häufige Fragen