🦠 E. coli und coliforme Bakterien im Wasser

Mikrobiologie PN-EN ISO 9308-1

Übersicht

Escherichia coli ist der wichtigste Indikator für fäkale Kontamination von Wasser. Das Vorhandensein von E. coli im Trinkwasser weist auf eine Kontamination mit menschlichen oder tierischen Fäkalien hin sowie auf ein potenzielles Risiko durch pathogene Bakterien, Viren und intestinale Protozoen. Coliforme Bakterien (Coliforme) umfassen eine breitere Gruppe — neben E. coli auch Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter — und dienen als allgemeiner Indikator für die Hygiene des Aufbereitungsprozesses.

Die Methode nach PN-EN ISO 9308-1 basiert auf der Membranfiltration einer Wasserprobe durch einen 0,45-µm-Filter, der die Bakterien zurückhält. Der Filter wird auf selektives chromogenes CCA-Medium (Chromogenic Coliform Agar) aufgelegt, das enzymatische Substrate enthält: Salmon-GAL (6-Chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid) für die β-Galactosidase der Coliformen und X-Glucuronid (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid) für die β-Glucuronidase von E. coli.

Nach Inkubation bei 36±2°C für 18–24 Stunden färben sich Coliforme-Kolonien rosa bis rot (β-Galactosidase-Aktivität) und E.-coli-Kolonien dunkelblau-violett (Aktivität beider Enzyme). Das Ergebnis wird direkt abgelesen — ohne Notwendigkeit einer biochemischen Bestätigung, was die Analyse erheblich beschleunigt.

Die Methode ist für Wässer mit geringer Begleitflora bestimmt — Trinkwasser, aufbereitetes Wasser, Grundwasser. Für Oberflächengewässer und Abwasser (hohe Begleitflora) wird PN-EN ISO 9308-2 verwendet (MPN-Methode mit Colilert-Medium).

Prinzip der Methode

Die Wasserprobe wird durch eine 0,45-µm-Membran (47 mm Durchmesser) filtriert, die Bakterien zurückhält. Die Membran wird auf die Oberfläche des chromogenen CCA-Mediums übertragen. Das Medium enthält zwei chromogene Substrate: Salmon-GAL, das von β-Galactosidase (Coliformes-Enzym) unter Bildung eines lachsrosa Produkts gespalten wird, und X-Glucuronid, das von β-Glucuronidase (E.-coli-spezifisches Enzym) unter Bildung eines dunkelblauen Produkts gespalten wird. Die Selektivität des Mediums wird durch Tergitol-7 gewährleistet, das das Wachstum grampositiver Bakterien und der meisten Nicht-Coliformen hemmt.

Anwendungen

• Kontrolle der Trinkwasserqualität (Gesetzblatt 2017 — E. coli: 0 KBE/100 mL)
• Überwachung des Wasserversorgungsnetzes — Probenahmestellen bei Verbrauchern
• Untersuchung von Grundwasser und Wasserentnahmestellen
• Kontrolle des Wassers nach Aufbereitung und Desinfektion
• Untersuchung von Flaschen- und Quellwasser
• Überwachung von Wasser in öffentlichen Gebäuden (Krankenhäuser, Schulen)
• Wasser für Produktionszwecke in der Lebensmittelindustrie
• Notfalluntersuchungen — nach Störungen im Wasserversorgungsnetz

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 9308-1:2014+A1:2017

Titel (PL)

Jakość wody — Oznaczanie ilościowe Escherichia coli i bakterii grupy coli — Część 1: Metoda filtracji membranowej do wód o małej ilości flory towarzyszącej

Title (EN)

Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria — Part 1: Membrane filtration method for waters with low bacterial background flora

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Arbeitsplatzvorbereitung

   Filtrationsanlage sterilisieren (Autoklav 121°C/15 min oder Flamme). CCA-Platten vorbereiten — 30 min vor Gebrauch aus dem Kühlschrank nehmen.

   ⏱ Zeit: 30 min

2. Chlorneutralisierung

   Bei chlorhaltiger Probe (Leitungswasser) Natriumthiosulfat hinzufügen (1,8 %-Tablette — 0,1 mL pro 100 mL Probe). Vorsichtig mischen.

   ⏱ Zeit: 2 min

3. Membranfiltration

   Sterilen 0,45-µm-Filter auf den Filtrationstrichter legen. 100 mL Probe einfüllen. Vakuumpumpe einschalten. Nach der Filtration Trichter mit 20 mL sterilem Peptonwasser nachspülen.

   ⏱ Zeit: 5 min

4. Filter auf Medium übertragen

   Mit steriler Pinzette den Filter auf die CCA-Platte übertragen. Sicherstellen, dass der Filter gleichmäßig aufliegt, ohne Luftblasen darunter.

   ⏱ Zeit: 2 min

5. Inkubation

   Platten umgedreht (Boden nach oben) im Brutschrank bei 36±2°C für 18–24 Stunden inkubieren. 24 Stunden nicht überschreiten.

   ⏱ Zeit: 18–24 h • 🌡 Temperatur: 36 ± 2°C

6. Ergebnisablesung — Coliforme

   Rosa bis rote Kolonien zählen (β-Galactosidase-positiv) = coliforme Bakterien. Optimale Anzahl: 10–100 Kolonien auf dem Filter.

   ⏱ Zeit: 10 min

7. Ergebnisablesung — E. coli

   Dunkelblau bis violette Kolonien zählen (β-Galactosidase- und β-Glucuronidase-positiv) = E. coli. E. coli ist in der Gesamtzahl der Coliformen enthalten.

   ⏱ Zeit: 10 min

8. Oxidase-Test (Bestätigung)

   Verdächtige Kolonien auf Oxidase-Streifen übertragen. E. coli ist Oxidase-negativ (kein Farbumschlag). Oxidase-positive Kolonien verwerfen.

   ⏱ Zeit: 5 min

9. Ergebnisberechnung

   Ergebnis = Anzahl bestätigter Kolonien pro 100 mL Probe. Für Trinkwasser gefordertes Ergebnis: 0 KBE/100 mL für sowohl E. coli als auch Coliforme.

10. Qualitätskontrolle

    Täglich: Negativkontrolle (steriles Wasser), Doppelbestimmung alle 10 Proben, CRM-Kontrollprobe. Wiederfindung 90–110 %.

    ⏱ Zeit: 15 min

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Wasserproben können Krankheitserreger enthalten — mit Nitrilhandschuhen und Laborkittel arbeiten
• Medien mit Kolonien nach Inkubation als infektiöses Material behandeln — vor Entsorgung autoklavieren
• Arbeit mit Bunsenbrenner — Verbrennungsgefahr, nicht unbeaufsichtigt lassen
• Natriumthiosulfat — geringes Risiko, Augenkontakt vermeiden
• UV-Lampe — nicht direkt in die Strahlungsquelle blicken, Gefahr von Augenschäden

Häufige Fragen