🦠 E. coli und coliforme Bakterien im Wasser — MPN-Verfahren mit enzymatischem Nährmedium (Colilert-18 / Quanti-Tray)

Mikrobiologie PN-EN ISO 9308-2

Übersicht

Die Anwesenheit und das Ausmaß einer fäkalen Verunreinigung sind ein wichtiger Faktor bei der Beurteilung der Wasserqualität und des Infektionsrisikos; die Untersuchung auf die Anwesenheit von Escherichia coli, die im Darm von Menschen und gleichwarmen Tieren lebt, weist auf eine solche Verunreinigung hin. Das Ergebnis für die coliformen Bakterien ist schwerer zu deuten, denn ein Teil von ihnen lebt im Boden und in Oberflächenwässern — ihre Anwesenheit beweist keine fäkale Verunreinigung, kann aber auf eine mangelhafte Aufbereitung oder auf das Eindringen von Wasser in das Netz hinweisen. ISO 9308-2:2012 (zweite Ausgabe, die ISO 9308-2:1990 ersetzt) legt ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von E. coli und coliformen Bakterien im Wasser fest, das auf dem Wachstum in einem flüssigen Nährmedium und der Berechnung der wahrscheinlichsten Keimzahl (MPN) aus Tabellen beruht. Es wird für alle Wasserarten angewendet, auch für solche mit einer großen Menge an Schwebstoffen und einem hohen Hintergrund an heterotrophen Bakterien; es darf nicht zur Bestimmung der coliformen Bakterien im Meerwasser verwendet werden, und für E. coli im Meerwasser wird gewöhnlich eine Verdünnung 1→10 in sterilem Wasser verlangt. Der Nachweis von E. coli beruht auf der Expression der β-D-Glucuronidase, weshalb das Verfahren viele enterohämorrhagische Stämme (z. B. O157) nicht erfasst, die dieses Enzym gewöhnlich nicht bilden — sie erscheinen als coliforme Bakterien. Das Ergebnis ist bestätigt, ohne dass die positiven Vertiefungen weiter bestätigt werden müssten. ISO weist darauf hin, dass die Anwendung der Norm mit Patenten von IDEXX (Colilert-18, Quanti-Tray) verbunden sein kann. In Polen weist die geltende Verordnung des Gesundheitsministers vom 22. Mai 2026 über die Qualität des für den menschlichen Gebrauch bestimmten Wassers (Dz.U. 2026 Pos. 748 — poln. Gesetzblatt), Anlage Nr. 4 Teil A Nr. 1, für E. coli und coliforme Bakterien als Referenzverfahren aus: die Norm PN-EN ISO 9308-1 ODER die Norm PN-EN ISO 9308-2 — beide gleichrangig. Ebenso bestimmte es die am 24.06.2026 aufgehobene Verordnung vom 7. Dezember 2017 (Dz.U. 2017 Pos. 2294 — poln. Gesetzblatt), sodass der Wechsel des Rechtsakts die Wahl der Norm nicht ändert.

Prinzip der Methode

Zu einer Wasserprobe (100 ml) oder zu einer auf 100 ml aufgefüllten Verdünnung wird eine Einwegpackung (Snap Pack) des dehydratisierten Nährmediums Colilert-18 (2,8 g) gegeben, bis zum Lösen gemischt und aseptisch in ein Quanti-Tray (bis 201 Organismen/100 ml, 51 Vertiefungen) oder ein Quanti-Tray/2000 (bis 2419 Organismen/100 ml, 97 Vertiefungen) gefüllt; die Trays werden im Quanti-Tray-Siegelgerät versiegelt und bei (36 ± 2) °C über 18–22 h bebrütet. Vertiefungen mit einer gelben Farbe, die der des Komparators gleich oder intensiver ist, gelten als positiv für coliforme Bakterien; gelbe Vertiefungen, die im UV (365 nm) eine beliebige Fluoreszenz zeigen — als positiv für E. coli. Die gelbe Färbung stammt aus dem Abbau des ortho-Nitrophenylgalactosids (ONPG) durch die β-D-Galactosidase, die Fluoreszenz aus dem Abbau des 4-Methylumbelliferyl-glucuronids (MUG) durch die β-D-Glucuronidase zum fluoreszierenden Methylumbelliferon. Ein coliformes Bakterium ist ein Angehöriger der Enterobacteriaceae, der die β-D-Galactosidase bildet, E. coli — einer, der beide dieser Enzyme bildet. Die MPN je 100 ml wird aus statistischen Tabellen oder mit einem Programm abgelesen; für das Tray mit 51 Vertiefungen gilt MPN = N·ln[N/(N − X)]. Das Nährmedium kann auch in der klassischen MPN-Anordnung von Röhrchen (z. B. 1 × 50 ml und 5 × 10 ml) oder als Anwesenheits-/Abwesenheitstest in 100 ml verwendet werden — dann werden die Röhrchen 20 min bei (36 ± 2) °C vorgewärmt. Für die Verdünnungen wird ausschließlich steriles, nicht hemmendes und oxidationsmittelfreies Wasser (entionisiertes oder Leitungswasser) verwendet; gepufferte, salzhaltige und peptonhaltige Verdünnungsmittel stören den Test.

Anwendungen

• Überwachung des Trinkwassers (Referenzverfahren nach der Verordnung des Gesundheitsministers vom 22. Mai 2026, Dz.U. 2026 Pos. 748 — poln. Gesetzblatt, Anlage Nr. 4 Teil A Nr. 1) und des Wassers in den Verteilungsnetzen — rasches Ergebnis nach 18 h
• Wässer mit einem hohen Gehalt an Schwebstoffen und einem hohen Hintergrund an Heterotrophen, bei denen die Membranfiltration versagt (Oberflächenwässer, Rohwässer, Brunnen)
• Meer- und Brackwässer — Bestimmung von E. coli nach einer Verdünnung 1→10 (coliforme Bakterien im Meerwasser ausgeschlossen)
• Anwesenheits-/Abwesenheitstest in 100 ml sowie die klassische MPN-Anordnung von Röhrchen mit demselben Nährmedium
• Laboratorien der Sanitär- und Epidemiologiestationen und der Wasserwerke — keine Bestätigung und kein Auszählen von Kolonien nötig

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 9308-2:2014-06 (ISO 9308-2:2012)

Titel (PL)

Jakość wody — Oznaczanie ilościowe Escherichia coli i bakterii grupy coli — Część 2: Metoda najbardziej prawdopodobnej liczby

Title (EN)

Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria — Part 2: Most probable number method

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Probenahme und Transport

   Nimm die Proben nach ISO 19458, transportiere und bewahre sie bei (5 ± 3) °C auf; beginne die Analyse am Tag der Probenahme oder binnen 18 h (ausnahmsweise bis 24 h).

2. Zugabe des Nährmediums

   Gib zu 100 ml der Probe (oder einer Verdünnung; Meerwasser gewöhnlich 1→10 in sterilem Wasser) aseptisch eine Packung Colilert-18 (2,8 g) und schüttle sanft bis zum vollständigen Lösen.

3. Füllen und Versiegeln

   Gieße die Probe mit dem Nährmedium in ein Quanti-Tray oder ein Quanti-Tray/2000 und versiegle es im Siegelgerät; alternativ fülle sie in sterile Röhrchen in MPN-Anordnung (z. B. 1 × 50 ml und 5 × 10 ml) oder bebrüte die gesamten 100 ml als Anwesenheits-/Abwesenheitstest — dann wärme 20 min bei (36 ± 2) °C vor.

4. Bebrütung

   Bebrüte die Trays 18–22 h bei (36 ± 2) °C.

5. Ablesung

   Erkenne als positiv für coliforme Bakterien die Vertiefungen an, deren gelbe Farbe mindestens der des Komparators entspricht; betrachte die Trays unter der UV-Lampe bei 365 nm in der Dunkelkammer — gelbe Vertiefungen mit einer beliebigen Fluoreszenz sind positiv für E. coli. Verlängere bei zweifelhafter Färbung nach 18 h die Bebrütung auf 22 h; positive Ergebnisse vor 18 h und negative nach 22 h sind gültig.

6. Berechnung und Prüfbericht

   Lies aus der Zahl der positiven Vertiefungen die MPN/100 ml für die coliformen Bakterien und für E. coli aus den Tabellen B.1/B.2 oder mit einem Programm ab; bei keiner positiven Vertiefung lautet das Ergebnis „< 1" (bei einer Verdünnung 1→10 — „< 10"). Gib das Verfahren, die Kennzeichnung der Probe, das Ergebnis und die Abweichungen an; führe Positiv-, Negativ- und Blindkontrollen mit.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Arbeit mit Material, das möglicherweise Darmpathogene enthält — Grundsätze der guten mikrobiologischen Praxis, Desinfektion und Autoklavieren der gebrauchten Trays
• UV-Lampe 365 nm — Augen- und Hautschutz beim Ablesen
• Das Siegelgerät wird heiß — die Heizelemente nicht berühren

Häufige Fragen