🍄 Hefen und Schimmelpilze in Lebensmitteln
Bestimmung von Hefen und Schimmelpilzen in Lebensmitteln mittels Oberflächenaussaat auf DRBC-Agar (Produkte mit aw > 0,95) oder DG18-Agar (Produkte mit aw ≤ 0,95) mit Inkubation bei 25°C für 5–7 Tage.
Übersicht
Hefen und Schimmelpilze sind allgegenwärtige Organismen, die für Lebensmittelverderb verantwortlich sind — sie verursachen Veränderungen in Geschmack, Geruch, Konsistenz und Aussehen von Lebensmitteln. Einige Schimmelpilze (Aspergillus, Penicillium, Fusarium) produzieren Mykotoxine — Sekundärmetabolite mit karzinogener, hepatotoxischer, nephrotoxischer und immunsuppressiver Wirkung (Aflatoxine, Ochratoxin A, Deoxynivalenol, Zearalenon).
Die Norm PN-EN ISO 21527 besteht aus zwei Teilen, angepasst an die Wasseraktivität (aw) des geprüften Produkts. Teil 1 behandelt Produkte mit aw > 0,95 (Milch, Fleisch, Eier, Gemüse, Obst, frische Teigwaren) und verwendet DRBC-Medium (Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar). Teil 2 behandelt Produkte mit aw ≤ 0,95 (getrocknete Früchte, Kuchen, Marmeladen, getrocknetes Fleisch, gesalzener Fisch, Getreide, Mehle, Nüsse, Gewürze) und verwendet DG18-Medium (Dichloran 18% Glycerol Agar).
In beiden Fällen erfolgt die Inkubation bei 25 ± 1°C für 5 Tage (mit möglicher Verlängerung auf 7 Tage). Dichloran und Bengalrosa beschränken die Ausbreitung schnell wachsender Schimmelpilze und verringern die Koloniegröße, wodurch Zählung ermöglicht wird. Chloramphenicol hemmt bakterielles Wachstum. Glycerol in DG18 senkt die aw des Mediums und begünstigt das Wachstum xerophiler und osmophiler Pilze.
Die Methode wird weit verbreitet in der Lebensmittelqualitätskontrolle, Umweltüberwachung von Produktionsanlagen und Haltbarkeitsbewertung eingesetzt. Sie umfasst nicht die Bestimmung von Schimmelpilzsporen oder Pilzartenidentifikation — dafür sind mykologische Methoden erforderlich.
Prinzip der Methode
Die Probe wird oberflächlich auf DRBC-Medium (aw > 0,95) oder DG18-Medium (aw ≤ 0,95) ausgesät. Dichloran (2,6-Dichlor-4-nitroanilin) beschränkt die Ausbreitung schnell wachsender Schimmelpilze (z.B. Rhizopus, Mucor). Bengalrosa verringert zusätzlich die Koloniegröße und erleichtert das Zählen. Chloramphenicol hemmt bakterielles Wachstum. In DG18 senkt Glycerol (18%) die Wasseraktivität des Mediums auf ca. 0,955, was das Wachstum osmophiler Hefen und xerophiler Schimmelpilze fördert. Nach 5 Tagen Inkubation bei 25°C zählen wir separat Hefekolonien (glatt, feucht, konvex) und Schimmelpilzkolonien (flaumig, fadenförmig, gefärbt).
Anwendungen
- Qualitätskontrolle von Obst, Gemüse und Obstsäften
- Untersuchung von Getreideprodukten — Mehl, Grütze, Flocken, Brot
- Überwachung getrockneter Produkte — Nüsse, Gewürze, getrocknete Früchte, Kräutertees
- Milchproduktkontrolle — Joghurt, Käse, Eiscreme
- Untersuchung von Marmeladen, Konfitüren, Sirupen und Honig
- Umweltüberwachung von Produktionsanlagen (Abstriche, Sedimentation)
- Mikrobiologische Haltbarkeitsbewertung von Lebensmitteln
- Kosmetik- und Nahrungsergänzungsmittelkontrolle
Schlüsselparameter
| Parameter | Wert |
|---|---|
| Inkubationstemperatur | 25 ± 1°C |
| Inkubationszeit | 5 Tage (mögliche Verlängerung auf 7 Tage) |
| Medium (aw > 0,95) | DRBC Agar (Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol) |
| Medium (aw ≤ 0,95) | DG18 Agar (Dichloran 18% Glycerol Agar) |
| Plattierungsmethode | Oberflächenaussaat (Spread Plate), 0,1 mL pro Platte |
| Zählbereich | 10–150 Kolonien pro Platte (typische und atypische) |
Norm
- Normnummer
- PN-EN ISO 21527-1:2009 / PN-EN ISO 21527-2:2009
- Titel (PL)
- Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby drożdży i pleśni — Część 1: Metoda liczenia kolonii w produktach o aktywności wodnej powyżej 0,95 / Część 2: Metoda liczenia kolonii w produktach o aktywności wodnej ≤ 0,95
- Title (EN)
- Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of yeasts and moulds — Part 1: Colony count technique in products with water activity greater than 0.95 / Part 2: Colony count technique in products with water activity ≤ 0.95
Schritt-für-Schritt-Verfahren
1. Wasseraktivitätsbestimmung des Produkts
Messen Sie die Proben-aw mit Wasseraktivitätsmessgerät. Wenn aw > 0,95 → verwenden Sie DRBC. Wenn aw ≤ 0,95 → verwenden Sie DG18.
2. Probenvorbereitung
Wiegen Sie 10 g Probe in einen Stomacher-Beutel, fügen Sie 90 mL gepuffertes Peptonwasser hinzu, homogenisieren Sie für 60–120 s. Bereiten Sie Dezimalverdünnungen vor.
3. Medienvorbereitung
Lösen Sie entsprechende Menge Medium (DRBC oder DG18) in destilliertem Wasser. Sterilisieren Sie im Autoklav (121°C/15 min). Kühlen Sie auf 47°C ab. Fügen Sie Chloramphenicol hinzu. Gießen Sie auf Platten (18–20 mL). Trocknen Sie die Oberfläche.
4. Oberflächenaussaat
Bringen Sie 0,1 mL Verdünnung auf Plattenoberfläche auf. Verteilen Sie mit Drigalski-Spatel. Führen Sie Duplikate durch. Lassen Sie bis zur Absorption des Inokulums.
5. Inkubation
Inkubieren Sie Platten in normaler Position (Boden nach unten) bei 25 ± 1°C. Drehen Sie Platten NICHT um — Schimmelpilze würden sich auf dem Deckel ausbreiten.
6. Ablesung nach 2–3 Tagen (Kontrolle)
Prüfen Sie Wachstum nach 2–3 Tagen. Markieren Sie schnell wachsende Schimmelpilze, die nach 5 Tagen Zählung behindern könnten.
7. Endablesung nach 5 Tagen
Zählen Sie separat Hefekolonien (glatt, feucht, cremig) und Schimmelpilzkolonien (flaumig, fadenförmig, gefärbt). Zählen Sie Platten mit 10–150 Kolonien. Wenn Wachstum nach 5 Tagen schwach ist, verlängern Sie Inkubation auf 7 Tage.
8. Berechnungen
Berechnen Sie die Anzahl von Hefen und Schimmelpilzen separat (oder zusammen) als gewichteten Durchschnitt aus Duplikaten. Ergebnis in KBE/g ausdrücken.
9. Qualitätskontrolle
Positivkontrolle: Saccharomyces cerevisiae (Hefe) und Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 (Schimmelpilz). Mediumsterilitätskontrolle.
Erforderliche Geräte und Apparatur
| Gerät | Beispiel | Richtpreis |
|---|---|---|
| Laborinkubator 25°C | Binder BD 56, Memmert IPP 110, POL-EKO ST 2 | 5.000–18.000 PLN |
| Laminar-Flow-Werkbank Klasse II | Thermo Scientific MSC-Advantage, ESCO Airstream AC2 | 25.000–60.000 PLN |
| Stomacher / Homogenisator | Seward Stomacher 400 Circulator | 12.000–25.000 PLN |
| Wasserbad 44–47°C | Memmert WNB 14, Julabo TW 12 | 3.000–10.000 PLN |
| Wasseraktivitätsmessgerät (aw) | Novasina LabMaster-aw, Rotronic HygroLab C1 | 8.000–25.000 PLN |
| Laborautoklav | Tuttnauer 2540M, Systec VX-65 | 15.000–45.000 PLN |
| Koloniezähler | Interscience Scan 300, Stuart SC6+ | 3.000–15.000 PLN |
Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien
| Reagenz | CAS | Details |
|---|---|---|
| DRBC Agar (Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol) | 99-30-9 | Medium für Produkte mit aw > 0,95; Pepton, Glucose, Dichloran, Bengalrosa, Chloramphenicol, Agar; 500 g Packung |
| DG18 Agar (Dichloran 18% Glycerol Agar) | 56-81-5 | Medium für Produkte mit aw ≤ 0,95; Pepton, Glucose, Dichloran, Glycerol 220 g/L, Chloramphenicol, Agar; 500 g Packung |
| Dichloran (2,6-Dichlor-4-nitroanilin) | 99-30-9 | Beschränkt Ausbreitung schnell wachsender Schimmelpilze, Konzentration 2 mg/L |
| Bengalrosa (Rose Bengal) | 632-69-9 | Farbstoff zur Begrenzung der Schimmelpilzkoloniegröße, Konzentration 25 mg/L |
| Chloramphenicol | 56-75-7 | Antibiotikum zur Hemmung bakteriellen Wachstums; 1% Lösung in Ethanol, Endkonzentration 100 mg/L |
| Glycerol | 56-81-5 | DG18-Komponente zur Senkung der Mediumwasseraktivität auf ~0,955; 220 g/L |
| Gepuffertes Peptonwasser (BPW) | — | Für Probenverdünnungen, 500 g Packung |
Arbeitsschutz und Sicherheit
- Einige Schimmelpilze produzieren Mykotoxine und Allergene — in Laminar-Flow-Werkbank arbeiten
- Schimmelpilzsporen werden leicht luftgetragen — schnelle Bewegungen beim Öffnen der Platten vermeiden
- Chloramphenicol — potenziell schädlich, Hautkontakt und Einatmen vermeiden
- Dichloran — reizend, Handschuhe und Laborkittel verwenden
- Gebrauchte Platten mit Schimmelpilzen vor Entsorgung autoklavieren (121°C/20 min)