🦠 Hefen und Schimmelpilze in Erzeugnissen mit aw > 0,95 — Oberflächenverfahren auf DRBC-Agar, 25 °C, 5 Tage

Mikrobiologie PN-ISO 21527-1

Übersicht

Status der Norm: PN-ISO 21527-1:2009 (Übernahme der ISO 21527-1:2008) wurde von PKN am 25. September 2020 ohne Angabe eines Nachfolgers zurückgezogen; die ISO 21527-1:2008 selbst bleibt gültig.

ISO 21527-1:2008 legt ein horizontales Verfahren zur Zahlbestimmung lebender Hefen und Schimmelpilze in Erzeugnissen für Menschen und Tiere mit einer Wasseraktivität von mehr als 0,95 — Eier, Fleisch, Milcherzeugnisse (ausgenommen Milchpulver), Obst, Gemüse, frische Pasten usw. — nach dem Koloniezählverfahren bei (25 ± 1) °C fest. Es erlaubt nicht, die Sporen der Schimmelpilze zu bestimmen; die Identifizierung der Pilze und die Untersuchung auf Mykotoxine liegen außerhalb des Anwendungsbereichs; das Verfahren eignet sich nicht für hitzeresistente Pilze (Byssochlamys fulva, B. nivea) in Obst- und Gemüsekonserven. Hefen werden als mesophile aerobe Mikroorganismen definiert, die bei 25 °C auf einem mykologischen Nährmedium matte oder glänzende, runde Kolonien mit regelmäßigem Rand und gewölbter Oberfläche bilden, und Schimmelpilze als mesophile aerobe fadenförmige Organismen, die flache oder flaumige, sich ausbreitende Kolonien bilden, oft mit farbigen Sporulationsstrukturen; die Unterscheidung ist bisweilen willkürlich. Die Norm warnt, dass das Zählen der Schimmelpilze besondere Vorsicht zum Schutz des Arbeitenden und vor der Kontamination der Luft mit Sporen erfordert. In Polen wurde sie als PN-ISO 21527-1:2009 eingeführt (sie ersetzte PN-ISO 7954:1999); PKN zog diese Norm am 25.09.2020 zurück, doch die ISO 21527-1:2008 gilt weiterhin, und die Lebensmittellaboratorien bestimmen die Zahl der Hefen und Schimmelpilze allgemein „nach PN-ISO 21527-1:2009". Teil 2 (ISO 21527-2) betrifft Erzeugnisse mit aw ≤ 0,95 und das Nährmedium DG18.

Prinzip der Methode

Es werden Platten hergestellt, die im Oberflächenverfahren mit einer festgelegten Menge der flüssigen Probe, der Erstverdünnung oder der Zehnerverdünnungen auf einem selektiven Nährmedium beimpft sind; die Platten werden aerob bei (25 ± 1) °C 5 Tage bebrütet und erforderlichenfalls 1–2 Tage in diffusem Tageslicht stehen gelassen; die Kolonien/Propagulen werden gezählt, und zweifelhafte Kolonien (Hefen oder Bakterien) werden unter der Binokularlupe (6,5–50×) oder dem Mikroskop (250–1000×) geprüft; die Zahl der Hefen und Schimmelpilze je g oder ml wird aus den Platten mit einer zählbaren Koloniezahl berechnet, wobei Schimmelpilze und Hefen erforderlichenfalls getrennt gezählt werden. Verdünnungsmittel: empfohlen wird 0,1 % Peptonwasser (Hydrolysat 1 g/l, pH 7,0 ± 0,2); den Verdünnungsmitteln können 0,05 % Tween 80 zugesetzt werden, um das Verklumpen der Sporen zu begrenzen. DRBC-Nährmedium (auf 1000 ml): Hydrolysat tierischer und pflanzlicher Gewebe 5 g, D-Glucose 10 g, KH₂PO₄ 1 g, MgSO₄·H₂O 0,5 g, Dichloran (2,6-Dichlor-4-nitroanilin) 0,002 g, Rose Bengal 0,025 g, Agar 12–15 g, Chloramphenicol 0,1 g; die Bestandteile ohne Chloramphenicol werden gekocht, der pH-Wert beträgt nach der Sterilisation 5,6 ± 0,2, es werden 10 ml einer 1 % Lösung von Chloramphenicol in Ethanol zugesetzt, es wird 15 min bei 121 °C sterilisiert, auf 44–47 °C abgekühlt und zu je 15 ml auf die Platten gegossen; das Nährmedium wird vor Licht geschützt (die zytotoxischen Abbauprodukte des Rose Bengal führen zu zu niedrigen Ergebnissen). Wahlweise: Chlortetracyclin 50 mg/l + Chloramphenicol 50 mg/l bei Überwucherung durch Bakterien (z. B. rohes Fleisch; Gentamicin nicht empfohlen), Spurenelemente (ZnSO₄, CuSO₄) für die vollständige Morphologie der Schimmelpilze, Tergitol 1 ml/l gegen die Überwucherung durch Mucoraceae. Leistungsprüfung des Nährmediums: Produktivität 5 Tage bei 25 °C mit Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763, Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus niger ATCC 16404, Mucor racemosus ATCC 42647 gegenüber SDA (PR ≥ 0,5); Selektivität — vollständige Hemmung von E. coli ATCC 25922 oder Bacillus subtilis ATCC 6633.

Anwendungen

• Erzeugnisse mit hoher Wasseraktivität: Fleisch und Wurstwaren, Eier und Eiprodukte, Joghurts, Käse, Sahne, Säfte und Obst, Gemüse, Salate, frische Pasten
• Beurteilung der Haltbarkeit und der Herstellungshygiene gekühlter Lebensmittel; Reklamationsuntersuchungen (Verderb durch Hefen)
• Feuchte Futtermittel und Rohstoffe
• Qualitätskontrolle mykologischer Nährmedien (Leistungsprüfung nach ISO/TS 11133)

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-ISO 21527-1:2009

Titel (PL)

Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby drożdży i pleśni — Część 1: Metoda liczenia kolonii w produktach o aktywności wody wyższej niż 0,95

Title (EN)

Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of yeasts and moulds — Part 1: Colony count technique in products with water activity greater than 0,95

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Herstellung des Nährmediums

   Suspendiere die DRBC-Bestandteile ohne Chloramphenicol, koche auf, stelle den pH-Wert so ein, dass er nach der Sterilisation 5,6 ± 0,2 beträgt, gib 10 ml 1 % Chloramphenicol in Ethanol zu, sterilisiere 15 min bei 121 °C, kühle auf 44–47 °C ab und gieße zu je 15 ml aus; trockne die Oberfläche der Platten nach ISO 7218 und bewahre sie im Dunkeln auf.

2. Probe und Verdünnungen

   Bereite die Erstverdünnung und die Zehnerverdünnungen nach ISO 6887 / ISO 8261 vor, empfohlenes Verdünnungsmittel — 0,1 % Peptonwasser (wahlweise 0,05 % Tween 80).

3. Ausbringen im Oberflächenverfahren

   Bringe eine festgelegte Menge der flüssigen Probe, der Erstverdünnung oder der Verdünnungen auf die Oberfläche der DRBC-Platten auf und verteile sie mit dem Drigalski-Spatel (< 2 mm Durchmesser, um die auf dem Drigalski-Spatel verbleibende Probenmenge zu minimieren).

4. Bebrütung

   Bebrüte aerob bei (25 ± 1) °C 5 Tage; lass die Platten erforderlichenfalls 1–2 Tage in diffusem Tageslicht stehen.

5. Zählung

   Zähle die Kolonien/Propagulen auf den Platten mit einer zählbaren Zahl; prüfe zweifelhafte Kolonien (Hefen oder Bakterien) unter der Binokularlupe oder dem Mikroskop; zähle erforderlichenfalls Schimmelpilze und Hefen getrennt.

6. Ergebnis

   Berechne die Zahl der Hefen und Schimmelpilze je g oder ml aus den Platten der gewählten Verdünnungen; gib die im Nährmedium verwendeten wahlweisen Zusätze und die Abweichungen an.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Sporen der Schimmelpilze — Arbeit mit größter Vorsicht, am besten in einer Werkbank, um den Arbeitenden zu schützen und die Laborluft nicht zu kontaminieren
• Chloramphenicol und Chlortetracyclin — Antibiotika; Staubbildung und Hautkontakt vermeiden; Dichloran und Rose Bengal — Einwaage mit Handschuhen
• Lichtempfindliches Nährmedium — die Abbauprodukte sind zytotoxisch

Häufige Fragen