🦠 Osmophile Hefen und xerophile Schimmelpilze in Erzeugnissen mit aw ≤ 0,95 — Oberflächenverfahren auf DG18-Agar, 25 °C, 5–7 Tage

Mikrobiologie PN-ISO 21527-2

Übersicht

Status der Norm: PN-ISO 21527-2:2009 (setzt ISO 21527-2:2008 um) wurde vom PKN am 25. September 2020 ohne Angabe eines Nachfolgers zurückgezogen; ISO 21527-2:2008 selbst bleibt gültig.

ISO 21527-2:2008 legt ein horizontales Verfahren zur Zahlbestimmung lebender osmophiler Hefen und xerophiler Schimmelpilze in Erzeugnissen für Menschen und Tiere mit einer Wasseraktivität kleiner oder gleich 0,95 fest (z. B. Trockenobst, Backwaren, Konfitüren, Trockenfleisch, Mehl und Getreide, Gewürze, Nüsse, Trockenfuttermittel); es erlaubt nicht die Bestimmung der Schimmelpilzsporen, und die Identifizierung der Pilze sowie die Untersuchung auf Mykotoxine liegen außerhalb seines Anwendungsbereichs. Das Verfahren eignet sich nicht für halophile xerophile Pilze (Polypaecilum pisce, Basipetospora halophila), die z. B. in getrockneten Fischen vorkommen. Osmophile Hefen und xerophile Schimmelpilze werden als Pilze definiert, die bei aw ≤ 0,95 zu wachsen vermögen; die übrigen Definitionen werden aus ISO 21527-1 übernommen. Die Laboratoriumsprobe darf nicht eingefroren werden. In Polen wurde die Norm als PN-ISO 21527-2:2009 eingeführt; das PKN hat sie am 25.09.2020 zurückgezogen, ISO 21527-2:2008 gilt jedoch weiterhin, und die Laboratorien bestimmen die Zahl der Hefen und Schimmelpilze in trockenen Erzeugnissen „nach PN-ISO 21527-2:2009". Teil 1 betrifft Erzeugnisse mit aw > 0,95 und das DRBC-Nährmedium.

Prinzip der Methode

Es werden Platten hergestellt, die im Oberflächenverfahren mit einer festgelegten Menge der Probe, der Erstverdünnung oder ihrer Verdünnungen auf einem selektiven Nährmedium beimpft und 5–7 Tage bei (25 ± 1) °C aerob bebrütet werden (bei Bedarf 1–2 Tage im diffusen Tageslicht); die Kolonien werden gezählt, zweifelhafte unter der Binokularlupe oder dem Mikroskop überprüft, und die Zahl je g oder ml wird aus den Platten mit einer auszählbaren Koloniezahl berechnet, wobei Hefen und Schimmelpilze erforderlichenfalls getrennt gezählt werden. Für die Verdünnungen wird ein Verdünnungsmittel mit einer ausreichenden Menge gelöster Substanz empfohlen — eine 20–35%ige Lösung von Glycerin oder D-Glucose —, um den osmotischen Schock der Zellen zu minimieren; darüber hinaus 0,1%iges Peptonwasser (pH 7,0 ± 0,2), wahlweise mit 0,05 % Tween 80. Wegen der raschen Sedimentation der Sporen wird die Pipette waagerecht gehalten und die Suspension geschüttelt; für die Homogenisierung wird ein Peristaltikhomogenisator bevorzugt. DG18-Nährmedium (je 1000 ml): Caseinhydrolysat 5 g, D-Glucose 10 g, KH₂PO₄ 1 g, MgSO₄·H₂O 0,5 g, Dichloran 0,002 g, wasserfreies Glycerin 220 g, Agar 12–15 g, Chloramphenicol 0,1 g; die Bestandteile ohne Chloramphenicol werden aufgekocht, der pH-Wert beträgt nach der Sterilisation 5,6 ± 0,2, es werden 10 ml 1%iges Chloramphenicol in Ethanol zugegeben, 15 min bei 121 °C sterilisiert, auf 44–47 °C abgekühlt und je 15 ml ausgegossen; vor Licht schützen. Optionen: Chlortetracyclin 50 mg/l + Chloramphenicol 50 mg/l (Gentamicin wird nicht empfohlen), Spurenelemente (ZnSO₄·7H₂O 1 g, CuSO₄·5H₂O 0,5 g/100 ml; 1 ml/l). Leistungsprüfung: Produktivität nach 5 Tagen bei 25 °C mit Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763, Wallemia sebi ATCC 42694, Aspergillus restrictus ATCC 42693, Eurotium rubrum ATCC 42690 gegenüber SDA (PR ≥ 0,5); Selektivität — vollständige Hemmung von E. coli ATCC 25922 und Bacillus subtilis ATCC 6633.

Anwendungen

• Trockene Erzeugnisse und Erzeugnisse mit verminderter Wasseraktivität: Trockenobst, Nüsse, Getreide und Mehl, Gewürze, Backwaren, Konfitüren, Trockenfleisch und gereifte Wurstwaren, Milchpulver
• Trockenfuttermittel und Futtermittelausgangserzeugnisse
• Risikobeurteilung xerophiler Schimmelpilze (Eurotium, Aspergillus restrictus, Wallemia) in gelagerten Rohstoffen
• Qualitätskontrolle mykologischer Nährmedien mit verminderter aw

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-ISO 21527-2:2009

Titel (PL)

Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby drożdży i pleśni — Część 2: Metoda liczenia kolonii w produktach o aktywności wody niższej lub równej 0,95

Title (EN)

Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of yeasts and moulds — Part 2: Colony count technique in products with water activity less than or equal to 0,95

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Nährmedium

   Suspendiere die DG18-Bestandteile ohne Chloramphenicol, koche sie auf, stelle den pH-Wert ein (nach der Sterilisation 5,6 ± 0,2), gib 10 ml 1%iges Chloramphenicol in Ethanol zu, sterilisiere 15 min bei 121 °C, kühle auf 44–47 °C ab, gieße je 15 ml aus, trockne die Oberfläche und bewahre im Dunkeln auf.

2. Probe

   Friere die Laboratoriumsprobe nicht ein; stelle die Erstverdünnung und die Verdünnungen nach ISO 6887 / ISO 7218 / ISO 8261 her, am besten in einem Verdünnungsmittel mit 20–35 % Glycerin oder Glucose (oder in 0,1%igem Peptonwasser), mit dem Peristaltikhomogenisator.

3. Oberflächenverfahren

   Schüttle die Suspensionen, halte die Pipette waagerecht; bringe eine festgelegte Menge auf die Oberfläche der DG18-Platten auf und verteile sie mit dem Drigalski-Spatel.

4. Bebrütung

   Bebrüte aerob bei (25 ± 1) °C 5–7 Tage; bei Bedarf 1–2 Tage im diffusen Tageslicht.

5. Zählen

   Zähle die Kolonien auf den Platten mit einer auszählbaren Zahl, überprüfe zweifelhafte unter der Binokularlupe oder dem Mikroskop; zähle erforderlichenfalls Hefen und Schimmelpilze getrennt.

6. Ergebnis

   Berechne die Zahl der Hefen und Schimmelpilze je g oder ml und gib die verwendeten wahlweisen Zusätze sowie die Abweichungen an.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Die Sporen xerophiler Schimmelpilze verbreiten sich leicht — vorsichtiges Arbeiten, in der Werkbank; Atemschutz bei trockenen, staubenden Proben
• Chloramphenicol, Chlortetracyclin, Dichloran — Staubbildung und Hautkontakt vermeiden
• Lichtempfindliches Nährmedium — im Dunkeln aufbewahren

Häufige Fragen