🦠 Hefen und Schimmelpilze in kosmetischen Mitteln — Koloniezählung auf Sabouraud-Glucose-Agar mit Chloramphenicol (25 °C, 3–5 Tage)

Mikrobiologie PN-EN ISO 16212

Übersicht

ISO 16212:2017 gibt allgemeine Leitlinien für die Bestimmung der Zahl der in kosmetischen Mitteln vorhandenen Hefen und Schimmelpilze durch Koloniezählung auf einem selektiven Agarnährboden nach aerober Bebrütung. Die Norm empfiehlt eine mikrobiologische Risikoanalyse, um festzulegen, auf welche Erzeugnisse sie anzuwenden ist; Erzeugnisse mit geringem Risiko (ISO 29621) sind solche mit niedriger Wasseraktivität, hydroalkoholische Erzeugnisse, Erzeugnisse mit extremem pH-Wert usw. Wegen der Vielfalt der Erzeugnisse kann das Verfahren nicht in jeder Einzelheit passen (z. B. bei bestimmten, mit Wasser nicht mischbaren Erzeugnissen); andere Verfahren (z. B. automatische) sind zulässig, nachdem ihre Gleichwertigkeit nachgewiesen wurde. Die gezählten Hefen können mit den Prüfungen aus den im Literaturverzeichnis genannten Normen identifiziert werden, die Schimmelpilze mit anderen geeigneten Verfahren. Hefen definiert die Norm als einzellige Pilze, die sich überwiegend vegetativ durch Sprossung vermehren, Schimmelpilze als Mikropilze, die ein Myzel bilden, samt ihren Sporen und Konidien, die unter den Prüfbedingungen wachstumsfähig sind.

In Polen gilt sie als PN-EN ISO 16212:2017-08 mit der Änderung A1:2023-01. Laboratorien, die kosmetische Mittel untersuchen, wenden sie zur Bestimmung der Pilze auf SDA parallel zu PN-EN ISO 21149 (Bakterien auf TSA) im Rahmen des Parameters „aerobe mesophile Mikroorganismen" an.

Prinzip der Methode

Das Verfahren beruht auf der Koloniezählung auf einem selektiven Agarnährboden; eine etwaige Hemmung des Pilzwachstums durch die Probe muss neutralisiert werden, und die Neutralisation der antimykotischen Eigenschaften des Erzeugnisses muss geprüft und nachgewiesen werden. Plattenzählverfahren: Herstellung von Platten im Plattenguss- oder im Oberflächenverfahren mit dem festgelegten Nährmedium und Beimpfung mit einer festgelegten Menge der Erstverdünnung oder einer weiteren Verdünnung; aerobe Bebrütung bei (25 ± 2,5) °C für 3–5 Tage; Zählung der KBE und Berechnung der Zahl der Hefen und Schimmelpilze je Milliliter oder Gramm des Erzeugnisses. Membranfiltration: Eine geeignete Menge der vorbereiteten Probe wird in die mit sterilem Verdünnungsmittel angefeuchtete Filtrationsapparatur überführt, sofort filtriert und gewaschen, das Filter wird auf die Oberfläche des Nährmediums gelegt (nach ISO 21148) und wie oben bebrütet. Als alternative Bedingung gilt (22,5 ± 2,5) °C für 5–7 Tage auf einem Nährmedium ohne Antibiotikum. Nährmedien: neutralisierendes Verdünnungsmittel SCDLP 20 (pankreatisch verdautes Casein 20,0 g, Sojalecithin 5,0 g, Polysorbat 20 40 ml, Wasser 960 ml; das Polysorbat wird in einem Bad bei (49 ± 2) °C gelöst, nach Zugabe der Bestandteile wird etwa 30 min erhitzt; Sterilisation 121 °C, 15 min; pH 7,3 ± 0,2), Fluid A (tierisches Pepton 1,0 g/l, pH 7,1 ± 0,2), Trypton-Natriumchlorid-Lösung für die Hefesuspension (Trypton 1,00 g, NaCl 8,50 g, pH 7,0 ± 0,2), Sabouraud-Glucose-Agar mit Chloramphenicol (SDCA: Dextrose 40,0 g, tierisches Pepton 5,0 g, pankreatisch verdautes Casein 5,0 g, Chloramphenicol 0,050 g, Agar 15,0 g, Wasser 1000 ml; Sterilisation 121 °C, 15 min; pH 5,6 ± 0,2) sowie Sabouraud-Glucose-Agar (SDA, ohne Chloramphenicol) für die Anzucht des Referenzstammes; bei bekannten und nicht mit Bakterien kontaminierten Erzeugnissen werden die Nährmedien ohne Chloramphenicol verwendet. Andere Verdünnungsmittel, Neutralisatoren und Nährmedien dürfen verwendet werden, nachdem ihre Eignung nachgewiesen wurde; zulässig sind dehydratisierte und gebrauchsfertige Nährmedien vergleichbarer Zusammensetzung oder Leistungsfähigkeit.

Anwendungen

• Routinekontrolle der mikrobiologischen Reinheit kosmetischer Mittel — Zahl der Hefen und Schimmelpilze (KBE/g, KBE/ml)
• Wasserbasierte Erzeugnisse mit hohem Risiko (Cremes, Gele, Lotionen) — Chargenfreigabe
• Erzeugnisse mit niedriger Pilzzahl — Variante mit Membranfiltration
• Prüfung der Wirksamkeit der Konservierung — Zählung der überlebenden Hefen und Schimmelpilze
• Bekannte, nicht mit Bakterien kontaminierte Erzeugnisse — Nährmedium ohne Chloramphenicol, Variante 22,5 °C / 5–7 Tage

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 16212:2017-08 + A1:2023-01 (ISO 16212:2017 + Amd 1:2022)

Titel (PL)

Kosmetyki — Mikrobiologia — Oznaczanie liczby drożdży i pleśni

Title (EN)

Cosmetics — Microbiology — Enumeration of yeast and mould

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Erstverdünnung

   Entnimm mindestens 1 g oder 1 ml des Erzeugnisses und stelle die Erstverdünnung in einem neutralisierenden Verdünnungsmittel (z. B. SCDLP 20) her; bereite die weiteren Verdünnungen vor.

2. Prüfung der Neutralisation

   Prüfe und weise die Wirksamkeit der Neutralisation der antimykotischen Eigenschaften des Erzeugnisses nach (Abschnitt 12 der Norm, Anhang D — Neutralisatoren).

3. Variante A — Plattenzählverfahren

   Bringe eine festgelegte Menge der Erstverdünnung oder einer weiteren Verdünnung im Plattengussverfahren oder im Oberflächenverfahren auf SDCA-Agar aus (bei nicht mit Bakterien kontaminierten Erzeugnissen — ohne Chloramphenicol).

4. Variante B — Membranfiltration

   Überführe eine geeignete Menge der Probe in die mit sterilem Verdünnungsmittel angefeuchtete Filtrationsapparatur, filtriere sofort, wasche nach Vorschrift und lege das Filter auf die Oberfläche des Agars (ISO 21148).

5. Bebrütung

   Bebrüte aerob bei (25 ± 2,5) °C für 3–5 Tage; alternativ bei (22,5 ± 2,5) °C für 5–7 Tage auf einem Nährmedium ohne Antibiotikum.

6. Zählung und Ergebnis

   Zähle die KBE und berechne die Zahl der Hefen und Schimmelpilze je ml oder g des Erzeugnisses; identifiziere erforderlichenfalls die Hefen (Prüfungen aus den Normen des Literaturverzeichnisses) oder die Schimmelpilze (andere geeignete Verfahren).

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Schimmelpilze bilden Sporen — Platten vorsichtig öffnen, Arbeit in der Sicherheitswerkbank; allergische Personen meiden die Exposition
• Chloramphenicol im Nährmedium — beim Einwiegen das Einatmen des Pulvers und den Hautkontakt vermeiden
• Heiße Nährmedien (Bad, Autoklav) — Verbrennungsgefahr

Häufige Fragen