🔴 Cronobacter spp. (Milchpulver)
Nachweis von Cronobacter spp. (früher Enterobacter sakazakii) in Milchpulver und Säuglingsnahrung durch Voranreicherung in BPW, selektive Anreicherung in mLST/Vancomycin und Isolierung auf chromogenem CCI-Agar.
Übersicht
Cronobacter spp. (früher Enterobacter sakazakii) ist ein opportunistischer Erreger, der eine ernsthafte Bedrohung für Neugeborene und Säuglinge darstellt, insbesondere Frühgeborene und Kinder mit verminderter Immunität. Cronobacter-Infektionen können zu Meningitis, Sepsis und nekrotisierender Enterokolitis führen — die Sterblichkeit erreicht 40–80% bei Neugeborenen. Die Hauptinfektionsquelle ist kontaminiertes Milchpulver (Säuglingsanfangsnahrung — PIF).
Die Norm PN-EN ISO 22964 beschreibt ein horizontales Verfahren zum Nachweis von Cronobacter spp. in Lebensmitteln, mit besonderem Schwerpunkt auf Milchpulver, Säuglingsnahrung und Umweltproben aus Anlagen zur Herstellung dieser Produkte. Die Methode umfasst drei Stufen: Voranreicherung in gepuffertem Peptonwasser (BPW), selektive Anreicherung in modifizierter Laurylsulfat-Tryptose-Bouillon mit Vancomycin (mLST/Vancomycin) und Isolierung auf chromogenem Agar (CCI — Chromogenic Cronobacter Isolation Agar).
Cronobacter zeigt charakteristische α-Glucosidase-Aktivität, die chromogenes Substrat in CCI-Agar hydrolysiert und blaugrüne (oder türkisfarbene) Kolonien bildet. Vancomycin in mLST-Bouillon hemmt das Wachstum grampositiver Bakterien und ermöglicht selektive Cronobacter-Anreicherung.
Cronobacter ist besonders gefährlich, weil es in Umgebungen mit niedriger Wasseraktivität überlebt (Milchpulver, Mehle, Kräutertees). Die Untersuchung ist gemäß Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 für Säuglingsanfangsnahrung in Pulverform vorgeschrieben (Kriterium: Abwesenheit in 10 g). Ein "nachgewiesen"-Ergebnis führt zum Rückruf der Produktcharge vom Markt.
Prinzip der Methode
Dreistufige Methode: (1) Voranreicherung — 25 g Probe in 225 mL BPW, Inkubation 37°C/18 h — Resuscitation geschädigter Zellen. (2) Selektive Anreicherung — 0,1 mL Transfer in 10 mL mLST mit Vancomycin, Inkubation 44°C/24 h — Cronobacter-Selektion (thermophiles Wachstum), Vancomycin hemmt Grampositive. (3) Isolierung — Aussaat auf chromogenem CCI-Agar (Chromogenic Cronobacter Isolation Agar), Inkubation 44°C/24 h. Cronobacter produziert α-Glucosidase, die chromogenes Substrat hydrolysiert — blaugrüne Kolonien. Bestätigung: Zuckerfermentation, gelbe Pigmentierung auf TSA, biochemische oder molekulare Identifikation.
Anwendungen
- Säuglingsmilchpulver (PIF) Qualitätskontrolle — Verordnung (EG) 2073/2005
- Säuglingsanfangsnahrung in Pulverform-Untersuchung
- Umweltüberwachung von Milchpulver-Produktionsanlagen
- Rohstoffkontrolle für Säuglingsnahrungsproduktion
- Nahrungsergänzungsmittel- und Lebensmittel für besondere medizinische Zwecke-Untersuchung
- Kräutertee-, Stärke- und Mehl-Überwachung (Cronobacter-Reservoire)
- Produktionsprozess- und Reinigungssystem (CIP)-Validierung
Schlüsselparameter
| Parameter | Wert |
|---|---|
| Voranreicherung | 37 ± 1°C, 18 ± 2 h in BPW |
| Selektive Anreicherung | 44 ± 1°C, 24 ± 2 h in mLST/Vancomycin |
| Isolierung | 44 ± 1°C, 24 ± 2 h auf CCI-Agar |
| Isolierungsmedium | CCI Agar (Chromogenic Cronobacter Isolation Agar) |
| Kolonietyp | Blaugrün (türkis) — α-Glucosidase-Aktivität |
| Probengröße | 10 × 25 g (insgesamt 250 g für PIF) |
Norm
- Normnummer
- PN-EN ISO 22964:2017
- Titel (PL)
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania Cronobacter spp.
- Title (EN)
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection of Cronobacter spp.
Schritt-für-Schritt-Verfahren
1. Probenvorbereitung
Wiegen Sie 25 g Milchpulver (PIF) in einen Stomacher-Beutel. Fügen Sie 225 mL gepuffertes Peptonwasser (BPW) vorgewärmt auf 45°C hinzu. Mischen Sie bis zur Auflösung. Für PIF werden 10 × 25 g (insgesamt 250 g) untersucht.
2. Voranreicherung in BPW
Inkubieren Sie die Suspension bei 37 ± 1°C für 18 ± 2 h. Resuscitationsphase — geschädigte Cronobacter-Zellen erlangen Wachstumsfähigkeit zurück.
3. Selektive Anreicherung in mLST/Vancomycin
Übertragen Sie 0,1 mL angereicherte Kultur in 10 mL mLST-Bouillon mit Vancomycin (10 mg/L). Inkubieren Sie 44 ± 1°C für 24 ± 2 h.
4. Isolierung auf CCI-Agar
Aus gelblicher mLST-Bouillon auf CCI-Agarplatte ausstreichen. Inkubieren Sie 44 ± 1°C für 24 ± 2 h.
5. Kolonieablesung
Suchen Sie nach typischen Cronobacter-Kolonien — blaugrün (türkis), Durchmesser 1–2 mm. Andere Enterobacteriaceae können als farblose oder rosa Kolonien wachsen.
6. Vorläufige Bestätigung
Wählen Sie min. 5 typische Kolonien. Subkultur auf TSA und inkubieren Sie 25°C für 48–72 h. Cronobacter bildet gelbe/gelb-orange Kolonien (Pigmentproduktion).
7. Biochemische Identifikation
Bestätigen Sie Isolate mit API 20E-, VITEK 2 GN-Tests oder molekularen Methoden (PCR). Cronobacter: Oxidase (−), Katalase (+), VP (+), Arginin-Dihydrolase (−).
8. Berichterstattung
Ergebnis: "Cronobacter spp. nachgewiesen/nicht nachgewiesen in 25 g (oder 10 × 25 g) Probe". Nachweis in PIF = sofortige Benachrichtigung der Aufsichtsbehörden und Chargenrückruf.
Erforderliche Geräte und Apparatur
| Gerät | Beispiel | Richtpreis |
|---|---|---|
| Laborinkubator 37°C | Binder BD 56, Memmert INB 200 | 5.000–18.000 PLN |
| Laborinkubator 44°C | Binder BD 56, Memmert INB 200, POL-EKO CLN 53 | 5.000–18.000 PLN |
| Laminar-Flow-Werkbank Klasse II | Thermo Scientific MSC-Advantage, ESCO Airstream | 25.000–60.000 PLN |
| Stomacher / Homogenisator | Seward Stomacher 400 Circulator | 12.000–25.000 PLN |
| Wasserbad 44–47°C | Memmert WNB 14, Julabo TW 12 | 3.000–10.000 PLN |
| Laborautoklav | Tuttnauer 2540M, Systec VX-65 | 15.000–45.000 PLN |
Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien
| Reagenz | CAS | Details |
|---|---|---|
| Gepuffertes Peptonwasser (BPW) | — | Für Voranreicherung; Pepton, NaCl, Na₂HPO₄, KH₂PO₄; 500 g Packung |
| mLST Broth (modified Lauryl Sulphate Tryptose Broth) | — | Selektive Bouillon; Natriumlaurylsulfat, Tryptose, NaCl; 500 g Packung |
| Vancomycin (Supplement für mLST) | 1404-93-9 | Antibiotikum zur Hemmung grampositiver Bakterien; Konzentration 10 mg/L; 10 Fläschchen Packung |
| CCI Agar (Chromogenic Cronobacter Isolation Agar) | — | Chromogener Agar mit Substrat für α-Glucosidase; Cronobacter-Kolonien blaugrün; 500 g Packung oder 20 Platten |
| TSA (Tryptone Soya Agar) | — | Nicht-selektives Medium zur Bestätigung — gelbe Pigmentierung von Cronobacter nach 48–72 h bei 25°C |
| Biochemische Tests API 20E oder VITEK | — | Zur biochemischen Identifikation bestätigter Isolate |
Arbeitsschutz und Sicherheit
- Cronobacter — BSL-2-Erreger, besonders gefährlich für Neugeborene und immunsupprimierte Personen
- Arbeit ausschließlich in Laminar-Flow-Werkbank Klasse II — strikte Einhaltung aseptischer Grundsätze
- Vancomycin — potenziell allergenes Antibiotikum, Handschuhe verwenden
- Gebrauchte Materialien vor Entsorgung autoklavieren (121°C/20 min)
- Oberflächendesinfektion mit 70% Ethanol oder 0,5% Natriumhypochlorit