🦠 Clostridium perfringens in Lebensmitteln
Bestimmung von Clostridium perfringens in Lebensmitteln mittels Gussplattenverfahren auf TSC-Agar (Tryptose Sulfite Cycloserine) mit Inkubation unter anaeroben Bedingungen bei 37°C für 20 ± 2 h.
Übersicht
Clostridium perfringens ist ein obligat anaerobes, grampositives, sporenbildendes Bakterium, das weit in der Umwelt verbreitet ist (Boden, Staub, menschlicher und tierischer Verdauungstrakt). Es ist eine der häufigsten Ursachen bakterieller Lebensmittelvergiftungen — CDC schätzt etwa 1 Million Fälle jährlich in den USA. Die Vergiftung wird durch CPE-Enterotoxin (Clostridium perfringens Enterotoxin) verursacht, das während der bakteriellen Sporulation im Darm produziert wird.
Typische C. perfringens-Vergiftung tritt nach Verzehr großer Mengen Bakterien (>10⁶ KBE/g) in unsachgemäß gelagerten Fleischgerichten (Eintopf, Fleischsoße, Braten), Geflügel und Hülsenfrüchten auf. Symptome (wässriger Durchfall, Bauchkrämpfe) treten 8–22 h nach Verzehr auf und klingen innerhalb von 24 h ab. C. perfringens-Sporen überleben das Kochen und keimen während langsamer Abkühlung der Gerichte (40–50°C) aus, wobei sie unter optimalen Bedingungen eine Generationszeit von nur 8–10 min erreichen.
Die Norm PN-EN ISO 7937 beschreibt ein horizontales Verfahren zur Bestimmung von C. perfringens auf TSC-Medium (Tryptose Sulfite Cycloserine Agar). Das Medium enthält Natriumsulfit — Reduktion von Sulfit zu Sulfid durch C. perfringens verursacht Ausfällung von Eisen(II)-sulfid und Bildung schwarzer Kolonien. D-Cycloserin hemmt das Wachstum von Begleitbakterien. Die Inkubation erfolgt unter anaeroben Bedingungen.
Die Bestätigung umfasst Nitratreduktionstest, Motilitätstest (C. perfringens ist unbeweglich) und Gelatineverflüssigung. Die Methode wird in der Qualitätskontrolle von Fertiggerichten, Catering-Gerichten, Fleisch und Fleischprodukten verwendet.
Prinzip der Methode
Die Probe wird auf TSC-Medium (Tryptose Sulfite Cycloserine Agar) mit optionalem Eigelb-Emulsionszusatz gegossen. C. perfringens reduziert Natriumsulfit zu Sulfid, das mit Eisen(II)-Ionen reagiert und unlösliches schwarzes Eisensulfid bildet — Kolonien sind schwarz. D-Cycloserin hemmt das Wachstum von Begleitbakterien (insbesondere grampositive Aerobier). Wenn Eigelb-Emulsion zugegeben wurde — erscheint opalisierender Hof um C. perfringens-Kolonien (Lecithinase-Aktivität). Inkubation unter strikt anaeroben Bedingungen bei 37°C für 20 ± 2 h. Bestätigung: Nitratreduktion (+), Motilität (−), Gelatineverflüssigung (+).
Anwendungen
- Qualitätskontrolle von Fertiggerichten und Catering-Gerichten
- Fleisch- und Fleischproduktuntersuchung (Eintopf, Braten, Soße)
- Catering-Einrichtungen und Kantinen-Überwachung
- Lebensmittelkontrolle in Institutionen (Krankenhäuser, Schulen, Pflegeheime)
- Hülsenfrüchte- und daraus zubereitete Gerichteuntersuchung
- Epidemiologische Untersuchung bei Lebensmittelvergiftungs-Ausbrüchen
- Kühl- und Aufwärmverfahren-Überprüfung (HACCP)
Schlüsselparameter
| Parameter | Wert |
|---|---|
| Inkubationstemperatur | 37 ± 1°C |
| Inkubationszeit | 20 ± 2 h |
| Atmosphäre | Strikt anaerob |
| Medium | TSC Agar (Tryptose Sulfite Cycloserine Agar) |
| Kolonietyp | Schwarz, Durchmesser 1–5 mm (Sulfitreduktion zu Eisensulfid) |
| Bestätigung | Nitratreduktion (+), Motilität (−), Gelatinase (+) |
Norm
- Normnummer
- PN-EN ISO 7937:2005
- Titel (PL)
- Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby Clostridium perfringens — Metoda liczenia kolonii
- Title (EN)
- Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of Clostridium perfringens — Colony-count technique
Schritt-für-Schritt-Verfahren
1. Probenvorbereitung
Wiegen Sie 10 g Probe, fügen Sie 90 mL BPW hinzu, homogenisieren Sie im Stomacher für 60–120 s. Bereiten Sie Dezimalverdünnungen vor.
2. TSC-Medium-Vorbereitung
Lösen Sie TSC Agar Base in destilliertem Wasser. Sterilisieren Sie im Autoklav (121°C/15 min). Kühlen Sie auf 45–50°C ab, fügen Sie aseptisch D-Cycloserin (und optional Eigelb-Emulsion) hinzu. Halten Sie im Wasserbad bei 47°C.
3. Gussplattierung
Übertragen Sie 1 mL jeder Verdünnung auf zwei sterile Petrischalen. Gießen Sie ca. 15 mL TSC-Medium (44–47°C). Mischen Sie vorsichtig. Lassen Sie erstarren.
4. Überschichtung
Nach dem Erstarren tragen Sie zusätzliche Schicht von ca. 10 mL TSC-Agar ohne Supplemente auf. Dies begrenzt den Sauerstoffzugang und die Kolonienausbreitung.
5. Anaerobe Inkubation
Platzieren Sie Platten im anaeroben Gefäß (Boden nach oben). Setzen Sie anaeroben Atmosphärengenerator (AnaeroGen) und Anaerobiose-Indikator ein. Verschließen Sie das Gefäß und inkubieren Sie bei 37 ± 1°C für 20 ± 2 h.
6. Kolonieablesung
Zählen Sie schwarze Kolonien (Durchmesser 1–5 mm). Wenn Eigelb zugegeben wurde — typische Kolonien umgeben von opalisierendem Hof (Lecithinase+). Zählen Sie Platten mit 15–150 Kolonien.
7. Isolat-Bestätigung
Wählen Sie min. 5 typische Kolonien. Subkultur auf Blutagar unter Anaerobiose (37°C/24 h). Führen Sie durch: Nitratreduktion (+ mit Griess-Reagenz), Motilität in SIM-Medium (−), Gelatineverflüssigung in Gelatine-Bouillon (+, 37°C/48 h).
8. Berechnungen und Berichterstattung
Berechnen Sie die Anzahl von C. perfringens unter Berücksichtigung des Prozentsatzes bestätigter Kolonien. Ergebnis in KBE/g ausdrücken. Ergebnis als "Clostridium perfringens" berichten.
Erforderliche Geräte und Apparatur
| Gerät | Beispiel | Richtpreis |
|---|---|---|
| Anaerobes System (Gefäße + Generatoren) | Oxoid AnaeroJar 2,5 L + AnaeroGen, Merck Anaerocult A | 500–2.000 PLN (Gefäß) + 300–500 PLN/10 Gen. |
| Laborinkubator 37°C | Binder BD 56, Memmert INB 200, POL-EKO CLN 53 | 5.000–18.000 PLN |
| Laminar-Flow-Werkbank Klasse II | Thermo Scientific MSC-Advantage, ESCO Airstream AC2 | 25.000–60.000 PLN |
| Stomacher / Homogenisator | Seward Stomacher 400 Circulator | 12.000–25.000 PLN |
| Wasserbad 44–47°C | Memmert WNB 14, Julabo TW 12 | 3.000–10.000 PLN |
| Laborautoklav | Tuttnauer 2540M, Systec VX-65 | 15.000–45.000 PLN |
Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien
| Reagenz | CAS | Details |
|---|---|---|
| TSC Agar Base (Tryptose Sulfite Cycloserine) | 7681-57-4 | Tryptose, Soja-Peptone, Hefeextrakt, Natriumsulfit, Eisenammoniumcitrat, Agar; 500 g Packung |
| D-Cycloserin (selektives Supplement) | 68-41-7 | Antibiotikum zur Hemmung des Wachstums von Begleitbakterien; Konzentration 400 mg/L; 10 Fläschchen Packung |
| Eigelb-Emulsion (optional) | — | Weist C. perfringens-Lecithinase-Aktivität nach — opalisierender Hof um Kolonien; 50 mL/L |
| Natriumsulfit | 7757-83-7 | Von C. perfringens zu Sulfid reduziert; TSC-Komponente |
| Eisenammoniumcitrat | 1185-57-5 | Liefert Eisenionen, die mit Sulfid reagieren — schwarze Kolonien; TSC-Komponente |
| Anaerobe Atmosphärengeneratoren | — | Oxoid AnaeroGen 2,5 L oder Merck Anaerocult A; 10 Stk. Packung |
| Gelatine-Bouillon und Griess-Reagenz | — | Für Bestätigungstests: Gelatinase und Nitratreduktion |
| Gepuffertes Peptonwasser (BPW) | — | Für Probenverdünnungen, 500 g Packung |
Arbeitsschutz und Sicherheit
- C. perfringens — BSL-2-Erreger mit Toxinproduktion und Sporenbildung, vollständige PSA verwenden
- Anaerobe Bedingungen — Vorsicht beim Öffnen anaerober Gefäße (plötzlicher Sauerstoffzufluss)
- D-Cycloserin — Antibiotikum, in großen Dosen neurotoxisch, Einatmen und Hautkontakt vermeiden
- Arbeit in Laminar-Flow-Werkbank Klasse II obligatorisch
- Gebrauchte Materialien autoklavieren (121°C/30 min) — Sporen erfordern längere Sterilisation
- Natriumsulfit — kann SO₂ freisetzen, Raumlüftung