🦠 Clostridium perfringens im Wasser
Quantitative Bestimmung von vegetativen Zellen und Sporen von Clostridium perfringens im Wasser mittels Membranfiltration auf TSC-Medium unter anaeroben Bedingungen.
Übersicht
Clostridium perfringens ist ein anaerobes, sporenbildendes grampositives Bakterium, dessen Anwesenheit im Wasser ausschließlich auf fäkale Kontamination hinweist. C.-perfringens-Sporen sind extrem resistent gegenüber chemischer Desinfektion (Chlorierung, Ozonung), UV-Strahlung, pH- und Temperaturänderungen — sie können in der aquatischen Umgebung Monate oder sogar Jahre überleben.
Diese außergewöhnliche Resistenz macht C. perfringens zu einem wertvollen ergänzenden Indikator zu E. coli und Enterokokken. Der Nachweis von C.-perfringens-Sporen in aufbereitetem Wasser deutet auf eine unzureichende Wirksamkeit der Filtrationsprozesse hin und kann auf eine alte fäkale Kontamination hinweisen, auch wenn E. coli und Enterokokken nicht mehr nachweisbar sind.
Die Methode nach PN-EN ISO 14189 umfasst die Membranfiltration der Wasserprobe, das Auflegen der Membran auf TSC-Medium (Tryptose-Sulfit-Cycloserin — Tryptose-Sulfit-Cycloserin-Agar) und Inkubation unter anaeroben Bedingungen bei 44±1°C für 21±3 Stunden. C. perfringens reduziert Sulfite zu Sulfiden, die mit Eisensalz im Medium reagieren und schwarze Kolonien bilden. Cycloserin hemmt das Wachstum von Bacillus-Arten.
C. perfringens ist ein Indikatorparameter von Trinkwasser gemäß der Gesundheitsministerium-Verordnung. Sein Nachweis in aufbereitetem Wasser sollte zu einer Bewertung der Wirksamkeit des Filtrationsprozesses und einer Überprüfung des Barrieresystems in der Wasseraufbereitungsanlage führen.
Prinzip der Methode
Die Wasserprobe (oder deren Verdünnung) wird durch eine 0,45-µm-Membran filtriert, die dann auf die Oberfläche des TSC-Mediums (Tryptose-Sulfit-Cycloserin-Agar) aufgelegt wird. Das Medium enthält Natriumsulfit (Na₂SO₃) und Eisenammoniumcitrat — C. perfringens reduziert Sulfit zu Sulfid (S²⁻), das mit Eisenionen einen schwarzen FeS-Niederschlag bildet und zu charakteristisch schwarzen Kolonien führt. Cycloserin (400 mg/L) hemmt selektiv Bacillus spp. Inkubation unter anaeroben Bedingungen (Anaerobier-Topf mit Gasgenerator) bei 44±1°C erhöht die Selektivität gegenüber C. perfringens.
Anwendungen
- Kontrolle der Trinkwasserqualität — Indikatorparameter (Gesundheitsministerium-Verordnung)
- Bewertung der Wirksamkeit des Filtrationsprozesses in Wasseraufbereitungsanlagen
- Nachweis alter fäkaler Kontamination von Grundwasser
- Überwachung von Oberflächengewässern als Trinkwasserquellen
- Untersuchung von Wasser nach Störungen im Wasserversorgungsnetz
- Bewertung der Integrität von Membransystemen (UF, NF) in Aufbereitungsanlagen
Schlüsselparameter
| Parameter | Wert |
|---|---|
| Ergebnis | KBE/100 mL (koloniebildende Einheiten) |
| Zulässiger Wert (Trinkwasser) | 0 KBE/100 mL (einschließlich Sporen) |
| Inkubationstemperatur | 44 ± 1°C |
| Inkubationszeit | 21 ± 3 Stunden |
| Inkubationsbedingungen | Anaerob (Anaerobiose) |
| Probenvolumen | 100 mL (Standard) |
Norm
- Normnummer
- PN-EN ISO 14189:2016
- Titel (PL)
- Jakość wody — Oznaczanie ilościowe Clostridium perfringens — Metoda filtracji membranowej
- Title (EN)
- Water quality — Enumeration of Clostridium perfringens — Method using membrane filtration
Schritt-für-Schritt-Verfahren
1. Arbeitsplatzvorbereitung
Filtrationsset sterilisieren. TSC-Platten mit Cycloserin-Supplement vorbereiten. Brutschranktemperatur prüfen (44°C).
2. Vorherige Probenerhitzung (optional)
Zur Bestimmung nur von Sporen: Probe im Wasserbad bei 75°C für 15 min erhitzen — tötet vegetative Formen ab. Für vegetative Formen + Sporen: diesen Schritt überspringen.
3. Chlorneutralisierung
Natriumthiosulfat zur Leitungswasserprobe hinzufügen. Mischen.
4. Membranfiltration
100 mL Probe durch 0,45-µm-Filter filtrieren. Trichter mit sterilem Peptonwasser nachspülen.
5. Auflegen auf TSC-Medium
Filter mit steriler Pinzette auf TSC-Mediumoberfläche übertragen. Dünne Schicht TSC-Medium (Overlay 5 mL) aufgießen, um anaerobe Bedingungen an der Oberfläche zu schaffen.
6. Anaerobe Inkubation
Platte in Anaerobier-Topf stellen. AnaeroGen-Beutel und Indikatorstreifen einlegen. Topf fest verschließen. Bei 44±1°C für 21±3 h inkubieren.
7. Ergebnisablesung
Topf öffnen. Schwarze Kolonien innerhalb von 30 Minuten zählen — Farbe verblasst schnell nach Luftkontakt! Schwarze/graue Kolonien = vorläufig C. perfringens.
8. Bestätigung — Saure-Phosphatase-Test
Kolonien auf Filterpapier übertragen. Saure-Phosphatase-Reagenz (α-Naphthylphosphat) auftragen. Rosa Verfärbung in 1–2 min = saure Phosphatase (+) = bestätigtes C. perfringens.
9. Subkultur auf Blutagar (optional)
Kolonien auf Blutagar übertragen. Anaerob bei 37°C/24 h inkubieren. C. perfringens zeigt doppelte Hämolyse-Zone (Beta-Hämolyse).
10. Ergebnisberechnung
Ergebnis = Anzahl bestätigter schwarzer Kolonien / Probenvolumen × 100. Angabe in KBE/100 mL.
11. Qualitätskontrolle
Positivkontrolle: C. perfringens ATCC 13124. Negativkontrolle: steriles Wasser. Anaerobiose-Indikatorstreifen prüfen.
Erforderliche Geräte und Apparatur
| Gerät | Beispiel | Richtpreis |
|---|---|---|
| Membranfiltrationsanlage | Sartorius Combisart, Merck EZ-Fit | 3 000–12 000 PLN |
| Anaerobier-Topf 2,5 L | Oxoid AG0025A, Merck Anaerocult | 800–2 000 PLN |
| Anaerobe Atmosphärengeneratoren | Oxoid AnaeroGen AN0025A, Merck Anaerocult A | 50–100 PLN/Stk. (Beutel) |
| Brutschrank 44°C | Binder BD 56, Memmert IN30plus | 6 000–18 000 PLN |
| Vakuumpumpe | KNF Laboport N 810 | 3 000–8 000 PLN |
| Autoklav | Tuttnauer ELV 2540 | 20 000–45 000 PLN |
| Lupe / Kolonienzähler | Stuart SC6+, Interscience Scan 500 | 1 500–25 000 PLN |
Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien
| Reagenz | CAS | Details |
|---|---|---|
| TSC-Agar (Tryptose-Sulfit-Cycloserin) | — | Selektivmedium ohne Eigelb. Zusammensetzung: Caseinhydrolysat, Hefeextrakt, Natriumsulfit, Eisenammoniumcitrat, Agar. Hersteller: Oxoid, Merck, Biokar |
| Cycloserin-Supplement | 68-41-7 | D-Cycloserin, Endkonzentration 400 mg/L. Hemmt das Wachstum von Bacillus spp. |
| Membranfilter 0,45 µm | — | MCE, 47 mm, steril. Merck Millipore, Sartorius |
| AnaeroGen-Beutel | — | Anaerobe Atmosphärengeneratoren für 2,5-L-Töpfe. O₂-Reduktion < 1 % in 30 min |
| Anaerobiose-Indikatorstreifen | — | Oxoid Anaerobic Indicator BR0055 — Kontrolle der anaeroben Bedingungen im Topf |
| Saure-Phosphatase-Testreagenz | — | α-Naphthylphosphat-Lösung + Diazoreagenz. Zur Bestätigung von C. perfringens (saure Phosphatase+) |
| Blutagar (Nährboden mit 5 % Schafblut) | — | Zur Subkultur und Bestätigung von hämolytischem C. perfringens |
| Natriumthiosulfat (Na₂S₂O₃) | 7772-98-7 | Neutralisierung von Chlor in Leitungswasserproben |
Arbeitsschutz und Sicherheit
- C. perfringens produziert Toxine (Alpha, Beta, Epsilon, Iota) — potenziell gefährlicher Krankheitserreger. Vollständige persönliche Schutzausrüstung
- Arbeit unter anaeroben Bedingungen — Töpfe unter Druck, vorsichtig öffnen
- Cycloserin — Antibiotikum, Hautkontakt vermeiden, mit Handschuhen arbeiten
- Natriumazid (in Medien) — hochgiftig, nicht ansäuern (setzt toxisches HN₃ frei)
- Infektiöses Material — vor Entsorgung autoklavieren 121°C/30 min
- Saure-Phosphatase-Reagenz — reizend, im Abzug verwenden