🦠 Sulfitreduzierende Clostridium spp. in Lebensmitteln, Futtermitteln, Umgebungsproben und Proben aus der Primärproduktion — Gussplattenverfahren in Eisensulfit-Agar mit Überschichtung, anaerobe Bebrütung bei 37 °C für 48 h, Bestätigung der Kolonien, wahlweise nur Sporen nach 10 min bei 80 °C, PN-EN ISO 15213-1

Mikrobiologie PN-EN ISO 15213-1

Übersicht

WAS DIESE NORM BESCHREIBT. Anwendungsbereich aus der PKN-Karte, vollständig (unsere Übersetzung): „Dieses Dokument legt die Zählung sulfitreduzierender Anaerobier sowie sulfitreduzierender Bakterien der Gattung Clostridium spp. mit dem Koloniezählverfahren fest. Die Norm gilt für: — Erzeugnisse für den menschlichen Verzehr; — Erzeugnisse für die Tierernährung; — Umgebungsproben aus dem Bereich der Herstellung und des Handels von Lebens- und Futtermitteln sowie — Proben aus der Primärproduktion. ANMERKUNG Dieses Verfahren wurde in einem Ringversuch für folgende Lebensmittelkategorien validiert: — verzehrfertige und aufwärmfertige Fleischerzeugnisse; — Eier und Eiprodukte (Derivate); — verarbeitetes Obst und Gemüse; — Säuglingsanfangsnahrung und Getreidebeikost für Säuglinge; — zusammengesetzte Lebensmittel oder Mahlzeitkomponenten. Es wurde auch für andere Produktkategorien validiert, d. h.: — Heimtierfutter und Futtermittel; — Umgebungsproben (aus der Umgebung der Lebens- oder Futtermittelherstellung). Das Verfahren wurde für mindestens fünf Lebensmittelkategorien validiert und ist daher auf eine breite Palette von Lebensmitteln anwendbar. Ausführliche Angaben zur Validierung enthalten Abschnitt 11 und Anhang C. Da das Verfahren für Proben aus der Primärproduktion nicht üblich ist, wurde diese Kategorie nicht in die Validierungsstudien einbezogen. Daher wurden für diese Kategorie keine Werte der Validierungsparameter ermittelt. Das dargestellte Verfahren ist (aber nicht ausschließlich) zur Zählung von Mikroorganismen in Untersuchungsproben geeignet und beruht auf der Zählung von mindestens 10 Kolonien je Platte. Dies entspricht einem Kontaminationsniveau, das bei flüssigen Proben über 10 KbE/ml oder bei festen Proben über 100 KbE/g liegen sollte.“ Der englische ISO-Text spricht im ersten Satz nur von sulfitreduzierenden Clostridium spp. Uns liegt ein Leseprobenauszug von ISO 15213-1:2023 (erste Ausgabe) vom Titelblatt bis Abschnitt 9.4.4 (Seite 5) vor.

NACH DER AUSGABE 2023 (Vorwort, Einleitung, Abschnitte 1–9.4.4). Die Norm wurde von ISO/TC 34/SC 9 „Microbiology“ in Zusammenarbeit mit CEN/TC 463 (Wiener Vereinbarung) erarbeitet; sie ersetzte ISO 15213:2003, und die Änderungen wurden als wesentlich eingestuft (nach ISO 17468), mit großem Einfluss auf die Leistungsmerkmale des Verfahrens: Der Anwendungsbereich wurde auf Proben aus der Primärproduktion erweitert; die Größe wurde von „sulfitreduzierende Bakterien“ auf „sulfitreduzierende Clostridium spp.“ geändert, daher werden typische Kolonien bestätigt; der Sulfitgehalt des Eisensulfit-Agars wurde von 1,0 g/l auf 0,5 g/l gesenkt; das Erhitzen für 10 min bei 80 °C wurde fakultativ (bei hoher Begleitflora oder wenn nur Sporen gezählt werden); die Beimpfung in Röhrchen und die Bebrütung bei 50 °C für thermophile sulfitreduzierende Bakterien wurden gestrichen; hinzugefügt wurden eine Beschreibung der Bestätigung, ein neues Fließschema in Anhang A, Leistungsmerkmale in Anhang C und ein besonderes Protokoll für Futtermittel in Anhang D. Einleitung: Sulfitreduzierende Clostridium spp. sind obligat anaerobe, grampositive, sporenbildende Stäbchen — darunter C. perfringens, C. bifermentans, C. sporogenes, C. botulinum — Indikatoren für Kontamination; die Zählung von C. perfringens beschreibt ISO 15213-2, seinen Nachweis ISO/TS 15213-3. Prinzip (Abschnitt 4): Eine festgelegte Menge der flüssigen Probe oder der Erstverdünnung wird in einer leeren Petrischale mit geschmolzenem Agar vermischt (Gussplatte), nach dem Erstarren wird eine Überschichtung gegossen, die ein Ausbreiten der Kolonien verhindert; die Platten werden 48 h bei 37 °C anaerob bebrütet und typische Kolonien gezählt — schwarz oder grau bis gelbbraun, gefärbt durch Eisen(II)-sulfid aus Sulfidionen und Eisen(III) im Nährboden; typische Kolonien werden bestätigt; ANMERKUNG: Ohne Bestätigung kann das Ergebnis als „anaerobe sulfitreduzierende Bakterien“ angegeben werden. Liegt die Zahl nahe der Bestimmungsgrenze, sind Doppelplatten vorzuziehen — Summe der Kolonien auf beiden mindestens 10, entsprechend mehr als 5 KbE/ml oder 50 KbE/g. Das Ergebnis wird in KbE je Gramm, Milliliter, Quadratzentimeter oder je Probenahmegerät angegeben. Geräte (Abschnitt 6): anaerobe Atmosphäre mit weniger als 1 % Sauerstoff und 9 % bis 13 % Kohlendioxid (Topf, Kammer oder Gasentwickler), Brutschrank 37 °C ± 1 °C, pH-Meter ± 0,1 bei 25 °C, Kühlschrank 5 °C ± 3 °C, Pipetten 10 ml und 1 ml, Ösen etwa 1 µl, Petrischalen etwa 90 mm und wahlweise etwa 140 mm, Wasserbad 44–47 °C und 80 °C ± 2 °C. Die Probenahme ist nicht Teil des Verfahrens — empfohlene Dokumente: ISO/TS 17728 (Lebens- und Futtermittel), ISO 707 (Milch), ISO 6887-3, ISO 13307 (Primärproduktion), ISO 17604 (Schlachtkörper), ISO 18593 (Oberflächen); Vorbereitung nach der Reihe ISO 6887, für Futtermittel nach Anhang D. Nur Sporen (9.3): Die Verdünnungsreihe wird im Wasserbad 10 min ± 1 min bei 80 °C erhitzt, spätestens 15 min nach Herstellung der Erstverdünnung (sonst höchstens 2 h in schmelzendem Eis); die Temperatur wird mit einem Thermometer in einer Referenzflasche überwacht; das Erreichen von 80 °C dauert höchstens 5 min (Wasser mindestens 4 cm über dem Probenniveau, Umwälzpumpe), die Zeit zählt ab Erreichen von 80 °C in der Referenzflasche, danach rasches Abkühlen auf etwa 20 °C; das Erhitzen verringert auch die Begleitflora (z. B. flüssige Molke, Silage). Beimpfung (9.4): je 1 ml der flüssigen Probe oder der Erstverdünnung (10⁻¹) in zwei 90-mm-Schalen, 1 ml der nächsten Verdünnung — 10⁻¹ (flüssig) oder 10⁻² (andere) — in eine weitere; die Bestimmungsgrenze lässt sich zehnfach senken, indem 10 ml der Erstverdünnung auf drei 140-mm-Schalen untersucht werden; gewählt werden Verdünnungen, die 10 bis 150 Kolonien je 90-mm-Schale oder 10 bis 360 je 140-mm-Schale ergeben.

STATUS (Stand der Karten am 30.09.2026). Die Karte von PN-EN ISO 15213-1:2023-08 (englische Fassung) hat keine Überschrift „Zurückgezogen“ — die Norm ist GÜLTIG: veröffentlicht 08-08-2023, 34 Seiten, Preisgruppe Q, Sektor Lebensmittel, Landwirtschaft und Forstwirtschaft, KT 3 für Mikrobiologie der Lebensmittelkette, ICS 07.100.30, „Übernimmt: EN ISO 15213-1:2023 [IDT], ISO 15213-1:2023 [IDT]“, „Ersetzt: PN-ISO 15213:2005 - polnische Fassung“, Berichtigung Ap1:2024-02. Die nationale Berichtigung PN-EN ISO 15213-1:2023-08/Ap1:2024-02 (genehmigt am 22. Februar 2024, Datei von der Karte gelesen) ergänzte auf dem Titelblatt im Feld „Ersetzt“ PN-ISO 15213:2005 und im nationalen Vorwort den Satz „Diese Norm ersetzt PN-ISO 15213:2005“. Die Karte von PN-ISO 15213:2005 „Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln — Horizontales Verfahren zur Zählung sulfitreduzierender Bakterien, die unter anaeroben Bedingungen wachsen“ — „Zurückgezogen und ersetzt durch PN-EN ISO 15213-1:2023-08“: veröffentlicht 29-06-2005, „Datum der Zurückziehung: 23-02-2024“, 12 Seiten, übernahm ISO 15213:2003, ersetzte PN-A-86034-12:1993. PKN-Suche nach „PN-EN ISO 15213“ (30.09.2026): PN-EN ISO 15213-1:2023-08 und PN-EN ISO 15213-2:2024-05 ohne Kennzeichnung, PN-ISO 15213:2005 — „Zurückgezogen und ersetzt durch“, sowie Normen PN-EN 15213-1…5 aus einem anderen Gebiet (Verkehrssysteme).

WIE VIELE LABORATORIEN UND IN WELCHER FORM (Kopie der Datenbank der Akkreditierungsumfänge, Datenstand bis 17.09.2026, gelesen am 30.09.2026). Alle Schreibweisen der Nummer 15213-1: 11 Datensätze bei 10 Laboratorien; in den aktuellen PCA-Dokumenten steht die Nummer in 13 Zellen — AB 924 hat in der Ausgabe Nr. 25 vom 16.09.2026 drei Positionen, die Kopie eine. Die Schreibweise „PN-EN ISO 15213-1:2023-08“ — 8 Laboratorien, darunter mit Berichtigung Ap1:2024-02 — AB 285, AB 313, AB 370, AB 819, AB 924 (AB 285 als „PN_EN ISO 15213-1:2023-08/Ap1:2024-02“); AB 400 schreibt „PN-EN ISO 15213-1“ und in einer zweiten Position „PN-ISO 15213-1“, AB 1179 — „PN-ISO 15213-1:2023-08“ (eine im PKN-Katalog nicht existierende Form); AB 370 zitiert die Norm „ohne Abschnitt 9.6“ (Bestätigung). Die Registerkarte „Laboratorien“ sucht Schreibweisen, die mit „PN-EN ISO 15213-1“ BEGINNEN, und zeigt 9 Laboratorien — nicht AB 1179; geprüft mit der Abfrage der Registerkarte auf dem Produktionsserver labcoda.pl am 30.09.2026: 9 (unter „PN-ISO 15213-1“ — 2). Aktuelle Umfänge auf den PCA-Seiten (gelesen am 30.09.2026, Ausgaben vom 30.10.2025 bis 16.09.2026): Die Positionen mit dieser Norm sind nicht ausgesetzt (bei AB 1179 ist ein anderer Teil des Umfangs ausgesetzt).

GRÖSSE UND GEGENSTAND. Bezeichnung der Größe: „Anzahl sulfitreduzierender Clostridium spp.“ — 7 Laboratorien (AB 285, AB 313, AB 400, AB 452, AB 462, AB 924, AB 1415); „Anzahl anaerober sulfitreduzierender Bakterien“ — AB 819; „Anzahl der Sporen anaerober sulfitreduzierender Bakterien“ — AB 370; „Anzahl sulfitreduzierender Bakterien, die unter anaeroben Bedingungen wachsen“ — AB 1179 (Wortlaut des Titels der zurückgezogenen PN-ISO 15213:2005). Technik: Plattenverfahren, Gussplatte — 9 Laboratorien, AB 452 — „horizontales Verfahren“. Gegenstand: Lebensmittel — Milch und Milcherzeugnisse, Fleisch und Fleischerzeugnisse, Fisch, Obst und Gemüse und ihre Erzeugnisse, Konzentrate, Süßwaren, Getreideerzeugnisse, Eier, Tiefkühlkost, Fertiggerichte (bei AB 285 auch Apfelsaft); AB 400 — Lebensmittel im flexiblen Akkreditierungsumfang. Die Positionen haben keine zahlenmäßigen Bereiche.

NEBEN DIESER NORM. Die zurückgezogene PN-ISO 15213:2005 steht in den aktuellen Umfängen von drei Laboratorien: AB 285 (zwei Positionen — anaerobe sulfitreduzierende Bakterien und ihre Sporen — neben der Position nach der neuen Norm, Ausgabe Nr. 28 vom 13.01.2026), AB 418 (Sporen von Anaerobiern, einschließlich sulfitreduzierender, in Abfällen) und AB 1866 (Anzahl anaerober sulfitreduzierender Mikroorganismen in Pflanzenhilfsmitteln, Ausgabe Nr. 4 vom 09.06.2026). Die qualitative Prüfung auf „Anwesenheit anaerober sporenbildender Bakterien und anaerober sulfitreduzierender Bakterien“ nach PN-A-82055-12 führen in den aktuellen Umfängen 5 Laboratorien durch (AB 400, AB 462, AB 483, AB 510, AB 1415; die Kopie hat noch AB 437, dessen Ausgabe vom 10.09.2026 diese Position nicht mehr enthält). Im Wasser werden Sporen sulfitreduzierender Clostridien durch Membranfiltration nach PN-EN 26461-2 gezählt und die Anzahl von Clostridium perfringens in Lebensmitteln nach PN-EN ISO 15213-2 (beide haben eigene Einträge in der Wissensdatenbank).

WO EIN SCHEINBAR KORREKTES ERGEBNIS LEICHT ENTSTEHT. Erstens — mit oder ohne Bestätigung: Das Ergebnis „sulfitreduzierende Clostridium spp.“ erfordert die Bestätigung typischer Kolonien; ohne sie erlaubt die Norm nur die Angabe „anaerobe sulfitreduzierende Bakterien“ — AB 370 schließt Abschnitt 9.6 aus und nennt die Größe „Sporen anaerober sulfitreduzierender Bakterien“. Zweitens — Sporen oder vegetative Zellen: Das Erhitzen für 10 min bei 80 °C ist fakultativ; das Ergebnis nach dem Erhitzen betrifft nur Sporen und ist mit einem Ergebnis ohne Erhitzen nicht vergleichbar — der Bericht muss dies angeben. Drittens — altes und neues Verfahren: Die Ausgabe 2023 hat einen Nährboden mit geringerem Sulfitgehalt (0,5 g/l statt 1,0 g/l), keine Bebrütung bei 50 °C und keine Beimpfung in Röhrchen — Ergebnisse nach der zurückgezogenen PN-ISO 15213:2005 sind mit Ergebnissen nach dieser Norm nicht austauschbar. Viertens — Grenze: Die Zählung erfordert mindestens 10 Kolonien je Platte — mehr als 10 KbE/ml oder 100 KbE/g; bei zwei Platten eine Summe von mindestens 10 — mehr als 5 KbE/ml oder 50 KbE/g; niedrigere Gehalte erfordern das Ausplattieren von 10 ml der Suspension auf 140-mm-Schalen. Fünftens — Anaerobie: Atmosphäre unter 1 % Sauerstoff während der gesamten Bebrütung; bei undichtem Topf gibt es weniger Kolonien.

WAS WIR NICHT ANGEBEN. Der Auszug endet mit Abschnitt 9.4.4: Wir geben weder den weiteren Ablauf der Beimpfung und des Gießens der Überschichtung (ab 9.4.5), die Zählung typischer Kolonien (9.5), die Bestätigung (9.6), die Angabe der Ergebnisse (10), die Validierungsdaten (11, Anhang C), die Zusammensetzung der Nährböden (Anhang B) noch das Protokoll für Futtermittel (Anhang D) an.

Prinzip der Methode

Die flüssige Probe bzw. die Erstverdünnung und ihre Verdünnungen werden in Petrischalen mit geschmolzenem Eisensulfit-Agar vermischt, nach dem Erstarren überschichtet und 48 h bei 37 °C anaerob bebrütet. Sulfitreduzierende Clostridium spp. bilden schwarze oder graue bis gelbbraune Kolonien (Eisen(II)-sulfid); typische Kolonien werden gezählt und bestätigt, das Ergebnis wird in KbE/g, KbE/ml, KbE/cm² oder je Probenahmegerät angegeben. Werden nur Sporen gezählt, werden die Verdünnungen 10 min bei 80 °C erhitzt.

Anwendungen

• Lebensmittel — Milch und Milcherzeugnisse, Fleisch, Fisch, Obst und Gemüse, Konzentrate, Süßwaren, Getreideerzeugnisse, Eier, Tiefkühlkost — in den Umfängen von 10 Laboratorien
• Futtermittel und Heimtierfutter, Umgebungsproben aus der Lebens- und Futtermittelherstellung, Proben aus der Primärproduktion — nach dem Anwendungsbereich der Norm

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 15213-1:2023-08 (wersja angielska; EN ISO 15213-1:2023, ISO 15213-1:2023 IDT) z poprawką PN-EN ISO 15213-1:2023-08/Ap1:2024-02

Titel (PL)

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Clostridium spp. — Część 1: Oznaczanie liczby Clostridium spp. redukujących siarczany(IV) metodą liczenia kolonii

Title (EN)

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Clostridium spp. — Part 1: Enumeration of sulfite-reducing Clostridium spp. by colony-count technique

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Probe und Verdünnungen

   Vorbereitung nach der Reihe ISO 6887 (Futtermittel — Anhang D); eine Reihe dezimaler Verdünnungen. PN-EN ISO 15213-1:2023-08 gültig (Stand der Karte am 30.09.2026).

2. Nur Sporen (Option)

   Verdünnungen im Wasserbad 10 min ± 1 min bei 80 °C erhitzen, spätestens 15 min nach Herstellung der Suspension; Erreichen von 80 °C ≤ 5 min; auf etwa 20 °C abkühlen.

3. Gussplatte

   Je 1 ml der flüssigen Probe oder der 10⁻¹-Suspension in zwei 90-mm-Schalen, 1 ml der nächsten Verdünnung in eine weitere; bei niedrigen Gehalten 10 ml Suspension auf drei 140-mm-Schalen; Eisensulfit-Agar und Überschichtung.

4. Bebrütung

   Anaerob (< 1 % O₂, 9–13 % CO₂), 37 °C, 48 h.

5. Zählung, Bestätigung, Ergebnis

   Schwarze oder graue bis gelbbraune Kolonien auf Platten mit 10–150 Kolonien (90 mm); Bestätigung typischer Kolonien (9.6 — NICHT ANGEGEBEN); ohne Bestätigung Ergebnis als „anaerobe sulfitreduzierende Bakterien“.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Kulturen können pathogene Clostridium-Arten enthalten (C. perfringens, C. botulinum) — Prüfungen nur in entsprechend ausgestatteten Laboratorien, unter Aufsicht eines Mikrobiologen, mit sicherer Entsorgung bebrüteter Materialien (Warnhinweis der Norm)
• FACHLICHER HINWEIS: Ohne Bestätigung der Kolonien lautet das Ergebnis „anaerobe sulfitreduzierende Bakterien“, nicht Clostridium spp.; Ergebnisse nach der zurückgezogenen PN-ISO 15213:2005 sind mit Ergebnissen nach dieser Norm nicht austauschbar

Häufige Fragen