🦠 Clostridium perfringens in Lebensmitteln und Futtermitteln — Plattengussverfahren mit Deckschicht auf TSC-Agar (37 °C, 20 h, anaerob)

Mikrobiologie PN-EN ISO 15213-2

Übersicht

ISO 15213-2:2023 legt die Bestimmung der Zahl von Clostridium perfringens mit der Koloniezähltechnik fest. Sie wird auf Erzeugnisse angewendet, die für den menschlichen Verzehr bestimmt sind, auf Futtermittel, auf Umgebungsproben aus der Erzeugung und dem Verkehr von Lebens- und Futtermitteln sowie auf Proben aus der Primärproduktion. Das Verfahren wurde in einem Ringversuch für verzehrfertige und zum Erhitzen bestimmte Fleischerzeugnisse, für Eier und Eiprodukte, für verarbeitete Früchte und Gemüse, für Säuglingsnahrung und -breie sowie für mehrkomponentige Lebensmittel und darüber hinaus für Heimtierfutter, Futtermittel und Umgebungsproben validiert — da es mindestens fünf Kategorien erfasste, ist es auf einen weiten Bereich von Lebensmitteln anwendbar (Abschnitt 11, Anhang C). In dieser Ausgabe ist die Hitzebehandlung von 10 min bei 80 °C optional geworden (bei hoher Begleitmikroflora); Anhang D beschreibt ein Verfahren zur molekularen Unterscheidung der für den Menschen pathogenen und der nicht pathogenen Stämme von C. perfringens.

Wenn die erwartete KBE-Zahl nahe der Bestimmungsgrenze liegt, werden Doppelplatten empfohlen (Summe der Kolonien auf beiden ≥ 10, was einer Kontamination von > 5 KBE/ml bei Flüssigkeiten oder > 50 KBE/g bei festen Erzeugnissen entspricht). Das Plattengussverfahren mit Deckschicht ist besonders für Erzeugnisse geeignet, bei denen schwärmende Kolonien zu erwarten sind, die die Zielkolonien verdecken. In Polen gilt sie als PN-EN ISO 15213-2:2024-05 (englische Fassung). Tryptose-Sulfit-Agar (TSC) mit D-Cycloserin-Supplement ist in Polen als Handelsnährboden erhältlich (Pulver, Flaschen, Platten).

Prinzip der Methode

Eine festgelegte Menge der flüssigen Probe oder der Erstverdünnung (bei anderen Erzeugnissen) wird in eine leere Petrischale gegeben und mit dem geschmolzenen Agarnährboden vermischt (Plattengussverfahren); weitere Platten werden aus den Zehnerverdünnungen nach der Normenreihe ISO 6887 hergestellt. Nach dem Erstarren wird eine Deckschicht aus demselben Agar aufgebracht, um die Entwicklung schwärmender Kolonien zu verhindern. Zählt man nur die Sporen, so wird die Verdünnungsreihe vor dem Ausbringen 10 min ± 1 min bei 80 °C erhitzt (im Wasserbad, binnen 15 min nach der Herstellung der Suspension, andernfalls stehen die Röhrchen bis zu 2 h in schmelzendem Eis; die Zeit bis zum Erreichen von 80 °C ≤ 5 min; nach dem Erhitzen sofortiges Abkühlen auf etwa 20 °C). In zwei Platten (etwa 90 mm) wird je 1 ml der flüssigen Probe oder der Erstverdünnung überführt (bei geringer erwarteter Zahl kann die Grenze um das Zehnfache gesenkt werden, indem 10 ml untersucht werden), in eine weitere 1 ml der Verdünnung 10⁻¹ (flüssiges Erzeugnis) oder 10⁻² (andere Erzeugnisse) usw., wobei mindestens zwei aufeinanderfolgende kritische Verdünnungsstufen gewählt werden. Es werden 12–15 ml (Platten von 90 mm) oder 30–35 ml (140 mm) TSC-Agar eingegossen, der geschmolzen und auf 44–47 °C temperiert ist, durch Schwenken gemischt, und nach dem Erstarren werden etwa 5 ml (90 mm) oder 12 ml (140 mm) TSC-Agar als Deckschicht aufgebracht. Die Platten werden umgedreht in anaerober Atmosphäre bei 37 °C über 20 h ± 2 h bebrütet; nach der Entnahme aus der anaeroben Atmosphäre werden binnen 30 min die typischen Kolonien gezählt — schwarze oder graue bis gelbbraune, deren Farbe samt der umgebenden Zone vom Eisen(II)-sulfid herrührt, das aus den Sulfidionen und dem im Nährmedium vorhandenen Eisen(III) entsteht — und zwar auf Platten mit < 150 präsumtiven Kolonien (90 mm). Bestätigung: Von jeder Platte werden 5 Kolonien auf einen nichtselektiven Blutagar (oder Nähragar) übertragen und anaerob bei 37 °C über 20 h ± 2 h bebrütet (die Platten dürfen vor dem Ablesen bis zu 48 h bei 5 °C gekühlt werden), anschließend wird die Prüfung auf saure Phosphatase durchgeführt (die Kolonien werden auf einem Papier mit dem Reagenz verrieben; eine purpurne Färbung binnen 3–4 min = positiv) sowie die Prüfung im Sulfit-Indol-Beweglichkeits-Agar (SIM, 22 h ± 2 h bei 37 °C: Sulfitreduktion, Indol, Beweglichkeit). Das Ergebnis wird als Zahl der bestätigten C. perfringens je Probenvolumen berechnet; Anhang D ermöglicht die molekulare Unterscheidung der für den Menschen pathogenen Stämme.

Anwendungen

• Verzehrfertige und zum Erhitzen bestimmte Fleischerzeugnisse, mehrkomponentige Gerichte, Catering — Indikator für Lebensmittelvergiftungen
• Eier und Eiprodukte, verarbeitete Früchte und Gemüse, Säuglingsnahrung und -breie (validierte Kategorien)
• Futtermittel und Heimtierfutter, Umgebungsproben aus der Lebens- und Futtermittelerzeugung, Primärproduktion
• Zählung ausschließlich der Sporen nach der Hitzebehandlung 80 °C/10 min (z. B. Beurteilung der Wirksamkeit der thermischen Behandlung)
• Unterscheidung der für den Menschen pathogenen und der nicht pathogenen Stämme (molekulares Verfahren aus Anhang D)

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 15213-2:2024-05 (ISO 15213-2:2023)

Titel (PL)

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Clostridium spp. — Część 2: Oznaczanie liczby Clostridium perfringens metodą liczenia kolonii

Title (EN)

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Clostridium spp. — Part 2: Enumeration of Clostridium perfringens by colony-count technique

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Einwaage, Suspension und Verdünnungen

   Stelle die Erstverdünnung und die Zehnerverdünnungen nach der Normenreihe ISO 6887 her.

2. Optionale Selektion der Sporen

   Zählst du nur die Sporen: erhitze die Verdünnungsreihe im Bad bei 80 °C über 10 min ± 1 min (Beginn nach dem Erreichen von 80 °C in der Referenzprobe; Erreichen ≤ 5 min), und zwar binnen 15 min nach der Herstellung der Suspension (andernfalls bewahre sie bis zu 2 h in schmelzendem Eis auf); kühle sofort auf etwa 20 °C ab.

3. Beimpfung

   Überführe in zwei Platten von 90 mm je 1 ml der flüssigen Probe oder der Erstverdünnung (bei geringer erwarteter Zahl — 10 ml, Grenze um das Zehnfache niedriger); in eine weitere Platte 1 ml der Verdünnung 10⁻¹ (Flüssigkeit) oder 10⁻² (andere Erzeugnisse); wiederhole mit den weiteren Verdünnungen mit einer neuen Pipette und wähle dabei mindestens zwei aufeinanderfolgende kritische Stufen.

4. Plattengussverfahren und Deckschicht

   Gieße 12–15 ml (90 mm) oder 30–35 ml (140 mm) TSC-Agar ein, der auf 44–47 °C temperiert ist, mische durch Schwenken und lass erstarren; bringe danach etwa 5 ml (90 mm) oder 12 ml (140 mm) TSC-Agar als Deckschicht auf.

5. Anaerobe Bebrütung

   Drehe die Platten um und bebrüte sie in anaerober Atmosphäre bei 37 °C über 20 h ± 2 h.

6. Zählung der typischen Kolonien

   Zähle binnen 30 min nach der Entnahme aus der anaeroben Atmosphäre die schwarzen oder grauen bis gelbbraunen Kolonien auf den Platten mit < 150 präsumtiven Kolonien.

7. Bestätigung

   Wähle von jeder Platte 5 Kolonien aus, bringe sie auf Blutagar (oder Nähragar) aus und bebrüte anaerob bei 37 °C über 20 h ± 2 h (Ablesen unmittelbar nach der Bebrütung; die Platten dürfen bis zu 48 h bei 5 °C gekühlt werden). Führe die Prüfung auf saure Phosphatase durch (purpurne Färbung binnen 3–4 min = positiv) und die SIM-Prüfung (22 h ± 2 h, 37 °C).

8. Ergebnis

   Berechne die Zahl der bestätigten C. perfringens je g oder ml der Probe; wende erforderlichenfalls das Verfahren aus Anhang D zur Unterscheidung der für den Menschen pathogenen Stämme an.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• C. perfringens bildet Toxine und ist eine Ursache von Lebensmittelvergiftungen — aseptisches Arbeiten, Autoklavieren der Kulturen
• Bad von 80 °C und geschmolzener Agar von 44–47 °C — Verbrennungsgefahr
• Anaerobe Systeme (Gasgeneratoren, Katalysatoren) — nach der Anleitung des Herstellers anwenden
• D-Cycloserin (Antibiotikum) im Nährmedium — bei der Zubereitung das Einatmen und den Hautkontakt vermeiden

Häufige Fragen