🦠 Sporen sulfitreduzierender Anaerobier (Clostridien) im Wasser — Membranfiltration
Kurz gefasst
Die Wasserprobe wird 15 min bei (75 ± 5) °C erhitzt, um die vegetativen Formen abzutöten, durch eine Membran von 0,2 µm filtriert; die Membran wird mit Sulfit-Eisen-Agar übergossen und anaerob bei (37 ± 1) °C bebrütet; die schwarzen Kolonien werden nach (20 ± 4) h und (44 ± 4) h gezählt. Die Prüfung erfolgt nach PN-EN 26461-2:2001 (EN 26461-2:1993, ISO 6461-2:1986); Auslese der Sporen: Erhitzen bei (75 ± 5) °C über 15 min ab dem Erreichen der Temperatur; Kontrolle mit einer Flasche mit Thermometer. Das Verfahren umfasst 6 Schritte; eingesetzt wird sie unter anderem für: Untersuchung natürlicher Mineralwässer, Quellwässer und Tafelwässer an der Fassung und in der Verpackung (Forderung 0 in 50 ml nach der Verordnung des Gesundheitsministers von 2011), Trinkwässer, Brunnen- und Quellwässer, schwach verunreinigte Oberflächenwässer — Volumen 100 ml, Beurteilung der Wirksamkeit der Aufbereitung und der Chlorung (die Sporen als Anzeiger einer weit zurückliegenden oder zeitweiligen Verunreinigung).
Auf einen Blick
- Norm: PN-EN 26461-2:2001 (EN 26461-2:1993, ISO 6461-2:1986)
- Kategorie: Mikrobiologie
- Verfahrensschritte: 6
- Auslese der Sporen: Erhitzen bei (75 ± 5) °C über 15 min ab dem Erreichen der Temperatur; Kontrolle mit einer Flasche mit Thermometer
- Filter: sterile Membran mit einem nominalen Porendurchmesser von 0,2 µm; Qualität nach ISO 7704
- Volumen: 100 ml (Trink-, Quell-, Brunnen-, Mineral-, Meer- und Oberflächenwässer); < 10 ml mit 10–100 ml sterilem Wasser mischen
Übersicht
Die Sporen sulfitreduzierender Anaerobier (Clostridien) sind in der Umwelt weit verbreitet: Sie kommen im Kot von Menschen und Tieren, im Abwasser und im Boden vor. Im Unterschied zu Escherichia coli und anderen coliformen Bakterien überleben die Sporen lange im Wasser, denn sie sind gegenüber chemischen und physikalischen Einflüssen widerstandsfähiger als die vegetativen Formen — sie können daher auf eine weit zurückliegende oder zeitweilige Verunreinigung hinweisen; sie sind mitunter sogar gegenüber der Chlorung in den bei der Aufbereitung angewendeten Dosen widerstandsfähig und deshalb für Kontrollzwecke brauchbar. ISO 6461/2-1986 (in Polen PN-EN 26461-2:2001) legt ein Verfahren zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung der Sporen der Clostridien durch Membranfiltration fest; es wird für alle Wasserarten angewendet, ausgenommen Proben, bei denen eine große Menge an Partikeln auf der Membran zurückgehalten würde. Die Clostridien werden als sulfitreduzierende, sporenbildende, anaerobe Mikroorganismen aus der Familie Bacillaceae und der Gattung Clostridium definiert. In Polen verlangt die Verordnung des Gesundheitsministers vom 31. März 2011 über natürliche Mineralwässer, Quellwässer und Tafelwässer (Dz.U. 2011 Nr. 85 Pos. 466 — poln. Gesetzblatt) den Ausschluss der Anwesenheit sulfitreduzierender Clostridien (einschließlich der Sporen) in 50 ml Wasser an der Fassung; die Laboratorien wenden diese Norm bei den Untersuchungen abgefüllter Wässer an (Zusammenstellungen der Nährmedien: Sulfit-Agar nach PN-EN 26461-2:2001).
Prinzip der Methode
Der Nachweis der Sporen in einem bestimmten Wasservolumen erfordert drei Stufen: die Auslese der Sporen durch Erhitzen der Probe für eine Zeit, die zur Zerstörung der vegetativen Bakterien ausreicht; die Filtration durch eine Membran mit Poren, die die Sporen zurückhalten (0,2 µm); das Aufbringen des Filters auf ein selektives Nährmedium (Sulfit-Eisen-Agar) und die Bebrütung bei (37 ± 1) °C über (20 ± 4) h und (44 ± 4) h mit dem Zählen der schwarzen Kolonien. Das Grundnährmedium ist Nähragar (Fleischextrakt, Pepton 10 g, NaCl 5 g, Agar, Wasser 1000 ml; pH 7,6 ± 0,1, eingestellt mit 1 mol/l NaOH; Sterilisation 20 min bei (121 ± 1) °C; zu je 18 ml in Röhrchen gefüllt, bei 4–5 °C aufbewahrt und nach 2 Wochen verworfen); unmittelbar vor dem Gebrauch werden zu 18 ml des geschmolzenen Nährmediums 1 ml Natriumsulfitlösung (10 g/100 ml, alle 2 Wochen frisch) und 5 Tropfen Eisen(II)-sulfat-Lösung (8 g/100 ml) gegeben. Eine Alternative ist der Tryptose-Sulfit-Agar (Tryptose 15 g, Soyton 5 g, Hefeextrakt 5 g, Natriumdisulfit, Ammoniumeisen(III)-citrat 1 g). Der pH-Wert der Nährmedien wird mit dem pH-Meter bezogen auf 25 °C gemessen, und die Qualität der Filter wird nach ISO 7704 überprüft, denn sie kann zwischen Marken und Chargen verschieden sein.
Anwendungen
- Untersuchung natürlicher Mineralwässer, Quellwässer und Tafelwässer an der Fassung und in der Verpackung (Forderung 0 in 50 ml nach der Verordnung des Gesundheitsministers von 2011)
- Trinkwässer, Brunnen- und Quellwässer, schwach verunreinigte Oberflächenwässer — Volumen 100 ml
- Beurteilung der Wirksamkeit der Aufbereitung und der Chlorung (die Sporen als Anzeiger einer weit zurückliegenden oder zeitweiligen Verunreinigung)
- Abwasser und stark verunreinigte Wässer — kleinere Volumina, nach dem Mischen mit sterilem Wasser filtriert
- Begleitender Anzeiger zu Clostridium perfringens (PN-EN ISO 14189) in der Wasserüberwachung
Schlüsselparameter
| Parameter | Wert |
|---|---|
| Auslese der Sporen | Erhitzen bei (75 ± 5) °C über 15 min ab dem Erreichen der Temperatur; Kontrolle mit einer Flasche mit Thermometer |
| Filter | sterile Membran mit einem nominalen Porendurchmesser von 0,2 µm; Qualität nach ISO 7704 |
| Volumen | 100 ml (Trink-, Quell-, Brunnen-, Mineral-, Meer- und Oberflächenwässer); < 10 ml mit 10–100 ml sterilem Wasser mischen |
| Nährmedium | Sulfit-Eisen-Agar (18 ml Nährmedium + 1 ml Na₂SO₃ 10 % + 5 Tropfen FeSO₄ 8 %), pH 7,6 ± 0,1; alternativ Tryptose-Sulfit-Agar |
| Bebrütung | (37 ± 1) °C anaerob; Ablesung nach (20 ± 4) h und (44 ± 4) h |
| Ergebnis | schwarze Kolonien je Probenvolumen; berichtet wird die Ablesung nach 44 h (die nach 20 h nur als Näherung) |
| Forderung (Mineralwässer, PL) | keine sulfitreduzierenden Clostridien (mit den Sporen) in 50 ml |
Norm
- Normnummer
- PN-EN 26461-2:2001 (EN 26461-2:1993, ISO 6461-2:1986)
- Titel (PL)
- Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe przetrwalników beztlenowców redukujących siarczyny (clostridia) — Część 2: Metoda filtracji membranowej
- Title (EN)
- Water quality — Detection and enumeration of the spores of sulfite-reducing anaerobes (clostridia) — Part 2: Method by membrane filtration
Schritt-für-Schritt-Verfahren
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Probenahme und Vorbereitung
Nimm die Proben nach ISO 5667-2 und ISO 8199; bewahre sie nach ISO 5667-3 auf.
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Auslese der Sporen
Erhitze die Probe im Wasserbad bei (75 ± 5) °C über 15 min, gerechnet ab dem Augenblick des Erreichens dieser Temperatur; benutze von Zeit zu Zeit eine Kontrollflasche mit demselben Wasservolumen und einem Thermometer, um die Aufheizzeit zu prüfen.
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Filtration
Filtriere nach ISO 7704 das geeignete Volumen: 100 ml für Trink-, Quell-, Brunnen-, Mineral-, Meer- und schwach verunreinigtes Oberflächenwasser; für stark verunreinigte Wässer und Abwasser weniger (Volumina < 10 ml mit 10–100 ml sterilem Wasser mischen). Wähle die Verdünnungen so, dass die Kolonien gut voneinander getrennt sind.
-
Übergießen der Membran mit dem Nährmedium
Überführe die Membran mit einer sterilen Pinzette mit der Filterseite nach unten auf den Boden der Petrischale, ohne Luftbläschen; halte sie fest und übergieße sie vorsichtig mit 18 ml des geschmolzenen vollständigen Nährmediums (mit Sulfit und Eisensulfat), das auf etwa 50 °C abgekühlt ist, und lass es erstarren.
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Bebrütung
Bebrüte anaerob (oder unter anderen Bedingungen, die die Anaerobiose sichern) bei (37 ± 1) °C über (20 ± 4) h und (44 ± 4) h; im Anaerobiertopf oder im anaeroben Brutschrank darf die Membran mit der Filterseite nach oben auf der Agaroberfläche liegen.
-
Ablesung und Prüfbericht
Zähle alle schwarzen Kolonien nach (20 ± 4) h und (44 ± 4) h; drücke das Ergebnis nach ISO 8199 als Zahl der sulfitreduzierenden Anaerobier (Clostridien) je Probenvolumen aus — gewöhnlich gilt die Ablesung nach 44 h, die nach 20 h nur als Näherung; beschreibe die Abweichungen und die Vorkommnisse, die das Ergebnis beeinflussen können.
Erforderliche Geräte und Apparatur
| Gerät | Beispiel | Richtpreis |
|---|---|---|
| Membranfiltrationsapparatur | Trichter, Unterteil, Vakuumpumpe | — |
| Wasserbad (75 ± 5) °C mit Thermometer | Kontrollflasche desselben Volumens zur Prüfung der Aufheizzeit | — |
| Brutschrank (37 ± 1) °C und anaerobes System | Anaerobiertopf oder anaerober Brutschrank (dann darf das Filter mit der Filterseite nach oben auf der Agaroberfläche liegen) | — |
| Autoklav, Dampfsterilisator, pH-Meter | Sterilisation der Nährmedien (121 ± 1) °C; pH bei 25 °C | — |
| Röhrchen 160 × 16 mm, Pipetten 10 ml (Teilung 0,1 ml), Kolben 2 l, Gefäße 1 l, Petrischalen, sterile Pinzetten | — |
Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien
| Reagenz | CAS | Details |
|---|---|---|
| Nähragar (Fleischextrakt, Pepton 10 g, NaCl 5 g, Agar, Wasser auf 1 l), pH 7,6 ± 0,1 | — | Grundnährmedium, zu je 18 ml abgefüllt |
| Natriumsulfit Na₂SO₃ — 10 g in 100 ml Wasser (alle 2 Wochen frisch) | — | selektiv-differenzierender Bestandteil (1 ml auf 18 ml Nährmedium) |
| Eisen(II)-sulfat FeSO₄ — 8 g kristallin in 100 ml Wasser | — | Indikator — schwarzes Eisensulfid um die Kolonien (5 Tropfen auf 18 ml) |
| Tryptose-Sulfit-Agar (Tryptose 15 g, Soyton 5 g, Hefeextrakt 5 g, Natriumdisulfit, Ammoniumeisen(III)-citrat 1 g/l) | — | alternatives Nährmedium |
| Natriumhydroxid 1 mol/l | — | Einstellen des pH-Werts des Nährmediums |
| Destilliertes oder entionisiertes Wasser ohne hemmende Stoffe (ISO 3696) | — | Nährmedien und Verdünnen kleiner Probenvolumina |
Arbeitsschutz und Sicherheit
- Kulturen von Anaerobiern der Gattung Clostridium (darunter möglicherweise C. perfringens) — Arbeit im mikrobiologischen Labor, Autoklavieren der Abfälle
- Heißes Wasserbad und geschmolzener Agar von etwa 50 °C — Vorsicht beim Übergießen der Membran
- Anaerobiertöpfe mit Gasgeneratoren — gehe nach der Anleitung des Herstellers vor
Häufige Fragen
Welche Norm beschreibt diese Prüfung?
Die Prüfung erfolgt nach PN-EN 26461-2:2001 (EN 26461-2:1993, ISO 6461-2:1986) — „Water quality — Detection and enumeration of the spores of sulfite-reducing anaerobes (clostridia) — Part 2: Method by membrane filtration“.
Wie funktioniert diese Methode?
Der Nachweis der Sporen in einem bestimmten Wasservolumen erfordert drei Stufen: die Auslese der Sporen durch Erhitzen der Probe für eine Zeit, die zur Zerstörung der vegetativen Bakterien ausreicht; die Filtration durch eine Membran mit Poren, die die Sporen zurückhalten (0,2 µm); das Aufbringen des Filters auf ein selektives Nährmedium (Sulfit-Eisen-Agar) und die Bebrütung bei (37 ± 1) °C über (20 ± 4) h und (44 ± 4) h mit dem Zählen der schwarzen Kolonien. Das Grundnährmedium ist Nähragar (Fleischextrakt, Pepton 10 g, NaCl 5 g, Agar, Wasser 1000 ml; pH 7,6 ± 0,1, eingestellt mit 1 mol/l NaOH; Sterilisation 20 min bei (121 ± 1) °C; zu je 18 ml in Röhrchen gefüllt, bei 4–5 °C aufbewahrt und nach 2 Wochen verworfen); unmittelbar vor dem Gebrauch werden zu 18 ml des geschmolzenen Nährmediums 1 ml Natriumsulfitlösung (10 g/100 ml, alle 2 Wochen frisch) und 5 Tropfen Eisen(II)-sulfat-Lösung (8 g/100 ml) gegeben.
Wie groß sind Messbereich und Genauigkeit?
Auslese der Sporen: Erhitzen bei (75 ± 5) °C über 15 min ab dem Erreichen der Temperatur; Kontrolle mit einer Flasche mit Thermometer; Filter: sterile Membran mit einem nominalen Porendurchmesser von 0,2 µm; Qualität nach ISO 7704; Volumen: 100 ml (Trink-, Quell-, Brunnen-, Mineral-, Meer- und Oberflächenwässer); < 10 ml mit 10–100 ml sterilem Wasser mischen; Nährmedium: Sulfit-Eisen-Agar (18 ml Nährmedium + 1 ml Na₂SO₃ 10 % + 5 Tropfen FeSO₄ 8 %), pH 7,6 ± 0,1; alternativ Tryptose-Sulfit-Agar.
Wie lange dauert die Prüfung?
Das Verfahren umfasst 6 Schritte. Die Norm gibt nicht für jeden Schritt eine Dauer an — maßgeblich ist das Verfahren des Labors.
Welche Geräte werden benötigt?
Membranfiltrationsapparatur, Wasserbad (75 ± 5) °C mit Thermometer, Brutschrank (37 ± 1) °C und anaerobes System, Autoklav, Dampfsterilisator, pH-Meter, Röhrchen 160 × 16 mm, Pipetten 10 ml (Teilung 0,1 ml), Kolben 2 l, Gefäße 1 l, Petrischalen, sterile Pinzetten.
Wo wird diese Prüfung eingesetzt?
Untersuchung natürlicher Mineralwässer, Quellwässer und Tafelwässer an der Fassung und in der Verpackung (Forderung 0 in 50 ml nach der Verordnung des Gesundheitsministers von 2011); Trinkwässer, Brunnen- und Quellwässer, schwach verunreinigte Oberflächenwässer — Volumen 100 ml; Beurteilung der Wirksamkeit der Aufbereitung und der Chlorung (die Sporen als Anzeiger einer weit zurückliegenden oder zeitweiligen Verunreinigung); Abwasser und stark verunreinigte Wässer — kleinere Volumina, nach dem Mischen mit sterilem Wasser filtriert; Begleitender Anzeiger zu Clostridium perfringens (PN-EN ISO 14189) in der Wasserüberwachung.
Welche Sicherheitsmaßnahmen gelten?
Kulturen von Anaerobiern der Gattung Clostridium (darunter möglicherweise C. perfringens) — Arbeit im mikrobiologischen Labor, Autoklavieren der Abfälle; Heißes Wasserbad und geschmolzener Agar von etwa 50 °C — Vorsicht beim Übergießen der Membran; Anaerobiertöpfe mit Gasgeneratoren — gehe nach der Anleitung des Herstellers vor.
Welches Labor führt diese Prüfung durch?
Die Prüfung führen nach ISO/IEC 17025 akkreditierte Labore durch. Auf LabCoda finden Sie sie über die Normnummer PN-EN 26461-2.