🌿 Chlorophyll a im Wasser

Physikochemie PN-ISO 10260

Übersicht

Chlorophyll a ist das wichtigste photosynthetische Pigment, das in allen photoautotrophen Organismen vorkommt — Algen, Cyanobakterien und Wasserpflanzen. Seine Konzentration im Wasser ist ein allgemein verwendeter Indikator für die Phytoplanktonbiomasse und den Eutrophierungsgrad von Gewässern. Die trophische Klassifizierung von Gewässern basiert weitgehend auf der Chlorophyll-a-Konzentration: oligotroph (<2,5 µg/L), mesotroph (2,5–8 µg/L), eutroph (8–25 µg/L) und hypereutroph (>25 µg/L).

Die spektrophotometrische Methode nach PN-ISO 10260 beruht auf der Konzentrierung des Phytoplanktons auf einem Glasfaserfilter (GF/C oder GF/F), der Extraktion der Pigmente mit Aceton (90%) und der Absorbanzmessung bei 665 nm (Absorptionsmaximum von Chlorophyll a) mit Korrektur auf Turbidimetrie bei 750 nm. Die Ansäuerung des Extrakts mit HCl ermöglicht die Unterscheidung zwischen aktivem Chlorophyll a und seinen Abbauprodukten (Phaeophytin a).

Die Überwachung von Chlorophyll a ist gemäß der Wasserrahmenrichtlinie (2000/60/EG) als Element der biologischen Bewertung des Zustands von Oberflächengewässern erforderlich. In Polen ist dieser Parameter bei der Bewertung des ökologischen Zustands von Seen und Stauseen obligatorisch (Dz.U. 2019 poz. 2149).

Alternativ kann Chlorophyll a fluoreszenzbasiert (empfindlicher, LOD ~0,1 µg/L) oder chromatographisch (HPLC — Trennung einzelner Pigmente) bestimmt werden. Die spektrophotometrische Methode bleibt jedoch aufgrund ihrer Einfachheit und geringen Kosten die Referenzmethode.

Prinzip der Methode

Das Phytoplankton aus einem definierten Wasservolumen (0,5–2 L) wird durch Vakuumfiltration auf einem Glasfaserfilter (GF/C, Porosität 1,2 µm oder GF/F, 0,7 µm) konzentriert. Der Filter mit dem Rückstand wird in 90% Aceton homogenisiert und im Dunkeln bei 4°C für 12–24 Stunden extrahiert. Der Extrakt wird durch Zentrifugation (500 g, 20 min) geklärt. Die Absorbanz wird bei 665 nm (Chlorophyll a) und 750 nm (Turbidimetriekorrektur) gemessen. Anschließend wird der Extrakt mit 0,1 M HCl angesäuert (0,1 mL pro 10 mL Extrakt) und nach 90 Sekunden die Absorbanz bei 665 und 750 nm erneut gemessen. Die Absorbanzdifferenz vor und nach der Ansäuerung ermöglicht die Berechnung der Konzentration von aktivem Chlorophyll a und Phaeophytin a. Berechnung: Chl a [µg/L] = 26,7 × (A665₀ - A665a) × V_Extrakt / (V_Probe × l), wobei l — optische Weglänge.

Anwendungen

• Eutrophierungsmonitoring von Seen und Stauseen (WRRL 2000/60/EG)
• Trophische Klassifizierung von Oberflächengewässern (oligotroph → hypereutroph)
• Bewertung des ökologischen Zustands von Gewässern — biologisches Element (Dz.U. 2019 poz. 2149)
• Überwachung von Algen- und Cyanobakterienblüten (Toxinrisiko)
• Qualitätskontrolle von Wasser an Oberflächenwasserfassungen
• Limnologische und ozeanographische Untersuchungen

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-ISO 10260:2002

Titel (PL)

Jakość wody — Pomiar parametrów biochemicznych — Spektrofotometryczne oznaczanie stężenia chlorofilu a

Title (EN)

Water quality — Measurement of biochemical parameters — Spectrometric determination of the chlorophyll a concentration

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Wasserprobenahme

   Repräsentative Wasserprobe (1–5 L) aus definierter Tiefe entnehmen. Im Dunkeln bei 4°C lagern. Innerhalb von 4 Stunden nach Entnahme filtrieren.

   🌡 Temperatur: 4°C

2. Filtration

   GF/C-Filter (47 mm) in die Vakuumfiltrationsapparatur einsetzen. Eine Prise MgCO₃ auf den Filter geben. Abgemessenes Probenvolumen (0,5–2 L) unter Vakuum (<0,3 bar) filtrieren.

   ⏱ Zeit: 15–60 min

3. Acetonextraktion

   Filter mit Rückstand in Zentrifugenröhrchen überführen. 10 mL 90% Aceton zugeben. Filter mit Ultra-Turrax homogenisieren (30 s). Verschließen, mit Aluminiumfolie umwickeln.

   ⏱ Zeit: 5 min

4. Inkubation im Dunkeln

   Röhrchen im Kühlschrank (4°C) für 12–24 Stunden im Dunkeln lagern. Aceton dringt in die Zellen ein und extrahiert die Pigmente.

   ⏱ Zeit: 12–24 h • 🌡 Temperatur: 4°C

5. Klärung des Extrakts

   Extrakt zentrifugieren (500 g, 20 min) oder durch GF/F-Filter filtrieren. Klaren Extrakt in sauberes Gefäß überführen.

   ⏱ Zeit: 25 min

6. Absorbanzmessung (vor Ansäuerung)

   Absorbanz bei 665 nm und 750 nm gegen 90% Aceton (Blindprobe) messen. Werte A665₀ und A750₀ notieren.

   ⏱ Zeit: 3 min

7. Ansäuerung mit HCl

   0,1 mL 0,1 M HCl zur Küvette mit 10 mL Extrakt zugeben. Vorsichtig durch Umdrehen mischen. Genau 90 Sekunden warten.

   ⏱ Zeit: 90 s

8. Absorbanzmessung (nach Ansäuerung)

   Absorbanz bei 665 nm und 750 nm messen. Werte A665a und A750a notieren. Ansäuerung konvertiert Chlorophyll → Phaeophytin.

   ⏱ Zeit: 3 min

9. Berechnung

   Chl a [µg/L] = 26,7 × [(A665₀ - A750₀) - (A665a - A750a)] × V_Extrakt [mL] / (V_Probe [L] × l [cm]). Phaeophytin a = 26,7 × [1,7 × (A665a - A750a) - (A665₀ - A750₀)] × V_E / (V_P × l).

   ⏱ Zeit: 5 min

10. Qualitätskontrolle

    Chlorophyll-a-Standard in Aceton (bekannte Konzentration) — Wiederfindung 90–110%. Aceton-Blindprobe A665 < 0,005. Duplikat: VK < 15%.

    ⏱ Zeit: 10 min

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Aceton — leicht entzündlich (Flammpunkt -20°C), Dämpfe bilden explosionsfähige Gemische, unter Abzug arbeiten!
• Salzsäure — ätzend, reizende Dämpfe, an belüftetem Ort verwenden
• Wasserproben — enthalten potenziell Cyanotoxine (Microcystine), Handschuhe tragen
• Schutzbrille, Laborkittel und Nitrilhandschuhe obligatorisch
• Acetonabfälle im Behälter für brennbare organische Abfälle sammeln

Häufige Fragen