🦠 Campylobacter spp. in Lebensmitteln — Zahlbestimmung auf mCCDA-Agar in mikroaerophiler Atmosphäre, 41,5 °C
Kurz gefasst
0,1 ml der Erstverdünnung (oder 1 ml auf eine große Platte bei niedrigen Zahlen) und der Verdünnungen werden im Oberflächenverfahren auf einen modifizierten Kohle-Cefoperazon-Desoxycholat-Agar (mCCDA) ausgebracht, 44 h ± 4 h bei 41,5 °C in mikroaerophiler Atmosphäre (5 % O₂, 10 % CO₂) bebrütet, und die gräulichen, flachen, feuchten Kolonien mit metallischem Glanz werden nach der Bestätigung gezählt (Morphologie und Beweglichkeit, Oxidase, kein aerobes Wachstum bei 25 °C); Referenzverfahren für das Kriterium 1000 KBE/g bei Masthähnchenschlachtkörpern. Die Prüfung erfolgt nach PN-EN ISO 10272-2:2017-10 (ISO 10272-2:2017; poprawka ISO 10272-2:2017/Amd 1:2023); Nährmedium: modifizierter Kohle-Cefoperazon-Desoxycholat-Agar (mCCDA); Zusammensetzung und Leistungsprüfung — Anhang B. Das Verfahren umfasst 6 Schritte; eingesetzt wird sie unter anderem für: Prozesshygienekriterium für Masthähnchenschlachtkörper nach dem Kühlen (Halshaut) — 1000 KBE/g, Referenzverfahren EN ISO 10272-2 (Verordnung 2073/2005 Pos. 2.1.9), Geflügelfleisch und anderes rohes Fleisch, Rohmilch, Proben aus der Primärproduktion — Kot, Staub, Abstriche in Geflügelbetrieben (Biosicherheit).
Auf einen Blick
- Norm: PN-EN ISO 10272-2:2017-10 (ISO 10272-2:2017; poprawka ISO 10272-2:2017/Amd 1:2023)
- Kategorie: Mikrobiologie
- Verfahrensschritte: 6
- Nährmedium: modifizierter Kohle-Cefoperazon-Desoxycholat-Agar (mCCDA); Zusammensetzung und Leistungsprüfung — Anhang B
- Bebrütung: 41,5 °C ± 1 °C, 44 h ± 4 h, mikroaerophile Atmosphäre (O₂ 5 ± 2 %, CO₂ 10 ± 3 %, wahlweise H₂ ≤ 10 %, Rest N₂)
- Inokulum: 0,1 ml je Platte von 90 mm; 1,0 ml auf eine Platte von 140 mm oder 3 × 90 mm (Doppelansätze) bei niedrigen Zahlen
Übersicht
ISO 10272-2:2017 legt ein horizontales Verfahren zur Zahlbestimmung von Campylobacter spp. in Erzeugnissen für Menschen und Tiere, in Umgebungsproben aus der Herstellung und dem Verkehr mit Lebensmitteln und Futtermitteln sowie in Proben aus der Primärproduktion (Tierkot, Staub, Abstriche) fest. Die erste Ausgabe ersetzte ISO/TS 10272-2:2006; die (als geringfügig eingestuften) Änderungen: Aufnahme der Proben aus der Primärproduktion, Beimpfung der Verdünnungen als Einzelansatz statt als Doppelansatz (entsprechend ISO 7218), Ersatz der Prüfungen des mikroaerophilen Wachstums bei 25 °C und des aeroben Wachstums bei 41,5 °C durch die Prüfung des aeroben Wachstums bei 25 °C, Aufnahme der Leistungsprüfung der Nährmedien (Anhang B) und der Verfahrenskenngrößen (Anhang C). Die Änderung Amd 1:2023 führte molekulare Verfahren zur Bestätigung und Identifizierung thermotoleranter Campylobacter sowie Änderungen in der Leistungsprüfung der Nährmedien ein. Campylobacter werden als Mikroorganismen definiert, die auf festen selektiven Nährmedien in mikroaerophiler Atmosphäre bei 41,5 °C charakteristische Kolonien bilden und eine charakteristische Morphologie, Beweglichkeit sowie biochemische und Wachstumsmerkmale aufweisen; die Norm betrifft die gesundheitlich bedeutsamen thermotoleranten Arten — am häufigsten C. jejuni und C. coli, auch C. lari, C. upsaliensis. Die Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 (Prozesshygienekriterium 2.1.9) nennt EN ISO 10272-2 als Referenzverfahren für Campylobacter spp. in Masthähnchenschlachtkörpern nach dem Kühlen: Grenzwert 1000 KBE/g, n = 50, c = 10 ab dem 1.1.2025 (zuvor 20, danach 15); bei Nichteinhaltung — Verbesserung der Schlachthygiene und der Biosicherheit in den Betrieben. Die Untersuchungen dürfen nur in entsprechend ausgestatteten Laboratorien unter der Aufsicht eines Mikrobiologen ausgeführt werden.
Prinzip der Methode
Die Zahlbestimmung erfordert drei aufeinanderfolgende Stufen (Anhang A): Herstellung der Zehnerverdünnungen nach ISO 6887 (eine einzige Reihe); Beimpfung eines festen selektiven Nährmediums — des modifizierten Kohle-Cefoperazon-Desoxycholat-Agars (mCCDA) — mit einer festgelegten Menge der flüssigen Probe oder der Erstverdünnung sowie der Verdünnungen, Bebrütung bei 41,5 °C in mikroaerophiler Atmosphäre und Beurteilung nach 44 h mit Aufzeichnung der Zahl der verdächtigen Kolonien; Bestätigung — Untersuchung der Morphologie und der Beweglichkeit unter dem Mikroskop, Überimpfung auf einen nichtselektiven Blutagar, Oxidase-Test und Prüfung des aeroben Wachstums bei 25 °C (wahlweise Artidentifizierung mit biochemischen und/oder molekularen Tests). Aufgebracht werden 0,1 ml der Suspension je mCCDA-Platte, bei niedrigen Zahlen — 1,0 ml auf eine Platte von 140 mm oder auf drei Platten von 90 mm (im Doppelansatz: zwei große oder sechs gewöhnliche); wird nur die Erstverdünnung verwendet, so wird ein Doppelansatz hergestellt. Das Inokulum wird rasch mit einem sterilen Drigalski-Spatel verteilt; das Trocknen der Platten ist für die Auszählbarkeit entscheidend, und jedes Laboratorium wendet sein eigenes standardisiertes Vorgehen an. Mikroaerophile Atmosphäre: 5 % ± 2 % O₂, 10 % ± 3 % CO₂, wahlweise ≤ 10 % H₂, Rest Stickstoff — in gasdichten Töpfen mit Gasentwicklungssystemen oder durch Füllen des Topfes bzw. des Brutschranks mit einem Gasgemisch. Die typischen Kolonien auf mCCDA sind gräulich, häufig mit metallischem Glanz, flach und feucht, mit einer Neigung zum Schwärmen (auf trockenerem Agar geringer); das Erkennen der Kolonien hängt in hohem Maße von der Erfahrung ab. Für den Oxidase-Test eignet sich keine Nickel-Chrom-Impföse. Campylobacter ist sehr empfindlich gegenüber dem Einfrieren und überlebt am besten bei niedrigen Temperaturen — die Proben nicht einfrieren, bei 3 °C aufbewahren, möglichst rasch untersuchen und vor dem Austrocknen schützen.
Anwendungen
- Prozesshygienekriterium für Masthähnchenschlachtkörper nach dem Kühlen (Halshaut) — 1000 KBE/g, Referenzverfahren EN ISO 10272-2 (Verordnung 2073/2005 Pos. 2.1.9)
- Geflügelfleisch und anderes rohes Fleisch, Rohmilch
- Proben aus der Primärproduktion — Kot, Staub, Abstriche in Geflügelbetrieben (Biosicherheit)
- Umgebungsproben aus Schlacht- und Zerlegebetrieben
- Quantitative Untersuchungen in der Risikobeurteilung und zur Wirksamkeit von Interventionen (Kühlen, Waschen der Schlachtkörper)
Schlüsselparameter
| Parameter | Wert |
|---|---|
| Nährmedium | modifizierter Kohle-Cefoperazon-Desoxycholat-Agar (mCCDA); Zusammensetzung und Leistungsprüfung — Anhang B |
| Bebrütung | 41,5 °C ± 1 °C, 44 h ± 4 h, mikroaerophile Atmosphäre (O₂ 5 ± 2 %, CO₂ 10 ± 3 %, wahlweise H₂ ≤ 10 %, Rest N₂) |
| Inokulum | 0,1 ml je Platte von 90 mm; 1,0 ml auf eine Platte von 140 mm oder 3 × 90 mm (Doppelansätze) bei niedrigen Zahlen |
| Bestätigung | Morphologie und Beweglichkeit (Mikroskop, am besten Phasenkontrast), Überimpfung auf Blutagar, Oxidase +, kein aerobes Wachstum bei 25 °C; wahlweise Artidentifizierung (Biochemie, PCR — Amd 1:2023) |
| Rechtliches Kriterium | Masthähnchenschlachtkörper: 1000 KBE/g, n = 50, c = 10 (ab 1.1.2025) |
| Aufbewahrung der Proben | ohne Einfrieren, 3 °C ± 2 °C, Analyse möglichst rasch, Schutz vor dem Austrocknen |
| Ergebnis | KBE/g, KBE/ml, KBE/cm² oder je Probenahmegerät |
Norm
- Normnummer
- PN-EN ISO 10272-2:2017-10 (ISO 10272-2:2017; poprawka ISO 10272-2:2017/Amd 1:2023)
- Titel (PL)
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania obecności i oznaczania liczby Campylobacter spp. — Część 2: Metoda liczenia kolonii
- Title (EN)
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. — Part 2: Colony-count technique
Schritt-für-Schritt-Verfahren
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Probe
Entnimm sie nach ISO/TS 17728 (Lebensmittel), ISO 13307 (Primärproduktion), ISO 17604 (Schlachtkörper) oder ISO 18593 (Oberflächen); friere sie nicht ein, bewahre sie bei 3 °C auf, untersuche sie rasch. Stelle die Erstverdünnung und eine einzige Reihe von Zehnerverdünnungen nach ISO 6887 her.
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Beimpfung
Überführe 0,1 ml der Erstverdünnung (oder der flüssigen Probe) und der weiteren Verdünnungen auf mCCDA-Platten; bei niedrigen Zahlen — 1,0 ml auf eine Platte von 140 mm oder auf drei Platten von 90 mm, im Doppelansatz; bei alleiniger Verwendung der Erstverdünnung stelle einen Doppelansatz her. Verteile rasch mit einem sterilen Drigalski-Spatel, ohne die Ränder zu berühren; trockne die Platten auf standardisierte Weise.
-
Mikroaerophile Bebrütung
Stelle die Platten in einen Topf mit Gasentwicklungssystem (streng nach der Anweisung des Herstellers) oder in einen Brutschrank mit Gasgemisch und bebrüte 44 h ± 4 h bei 41,5 °C.
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Zählen der verdächtigen Kolonien
Zeichne die Zahl der typischen/verdächtigen Kolonien auf: gräulich, häufig mit metallischem Glanz, flach und feucht, schwärmende Kolonien; andere Formen sind möglich.
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Bestätigung
Betrachte ausgewählte Kolonien unter dem Mikroskop (Morphologie, Beweglichkeit), überimpfe sie auf Blutagar, führe den Oxidase-Test (eine andere Impföse als Ni-Cr) und die Prüfung des aeroben Wachstums bei 25 °C aus (Campylobacter wächst nicht); identifiziere wahlweise die Art mit biochemischen oder molekularen Tests.
-
Ergebnis
Berechne aus der Zahl der bestätigten typischen Kolonien je Platte die Zahl von Campylobacter in KBE/g, ml, cm² oder je Probenahmegerät; vergleiche sie mit dem Kriterium 1000 KBE/g für Masthähnchenschlachtkörper.
Erforderliche Geräte und Apparatur
| Gerät | Beispiel | Richtpreis |
|---|---|---|
| Brutschränke 25 °C ± 1 °C, 37 °C ± 1 °C und 41,5 °C ± 1 °C | aerobes Wachstum bei 25 °C — Bestätigungstest | — |
| Gasdichte Töpfe mit Gasentwicklungssystemen oder Brutschrank mit Gasgemisch | mikroaerophile Atmosphäre 5 % O₂, 10 % CO₂ | — |
| Mikroskop mit Phasenkontrast | Morphologie und Beweglichkeit von Campylobacter | — |
| Sterile Petrischalen 90 mm und wahlweise 140 mm (am besten mit Belüftung) | — | |
| Impfösen 10 µl und 1 µl (keine Ni-Cr-Impföse für die Oxidase), Impfnadel, Wasserbad 37 °C ± 1 °C, Kühlschränke 3 °C ± 2 °C und 5 °C ± 3 °C | — |
Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien
| Reagenz | CAS | Details |
|---|---|---|
| mCCDA-Agar (modifizierter Kohle-Cefoperazon-Desoxycholat-Agar) — Basisnährmedium mit Antibiotikum-Supplement (Anhang B) | — | selektives Koloniezählen |
| Blutagar (nichtselektiv) | — | Reinkulturen für die Bestätigung |
| Reagenz für den Oxidase-Test | — | Bestätigung (Oxidase positiv) |
| Verdünnungsmittel nach ISO 6887 | — | Erstverdünnung und eine einzige Reihe von Verdünnungen |
| Kontrollstämme und Sätze für die biochemische/molekulare Identifizierung (wahlweise) | — | Leistungsprüfung der Nährmedien, Artidentifizierung |
Arbeitsschutz und Sicherheit
- Campylobacter ist ein Krankheitserreger des Menschen — Untersuchungen nur in entsprechend ausgestatteten Laboratorien unter der Aufsicht eines Mikrobiologen, sorgfältige Entsorgung der Materialien nach der Bebrütung
- Gasentwicklungssysteme und Gemische mit Wasserstoff (≤ 10 %) — Vorgehen nach der Anweisung des Herstellers, gasdichte Töpfe
- Cefoperazon und andere Antibiotika in den Supplementen — Staubbildung und Kontakt vermeiden
Häufige Fragen
Welche Norm beschreibt diese Prüfung?
Die Prüfung erfolgt nach PN-EN ISO 10272-2:2017-10 (ISO 10272-2:2017; poprawka ISO 10272-2:2017/Amd 1:2023) — „Microbiology of the food chain — Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. — Part 2: Colony-count technique“.
Wie funktioniert diese Methode?
Die Zahlbestimmung erfordert drei aufeinanderfolgende Stufen (Anhang A): Herstellung der Zehnerverdünnungen nach ISO 6887 (eine einzige Reihe); Beimpfung eines festen selektiven Nährmediums — des modifizierten Kohle-Cefoperazon-Desoxycholat-Agars (mCCDA) — mit einer festgelegten Menge der flüssigen Probe oder der Erstverdünnung sowie der Verdünnungen, Bebrütung bei 41,5 °C in mikroaerophiler Atmosphäre und Beurteilung nach 44 h mit Aufzeichnung der Zahl der verdächtigen Kolonien; Bestätigung — Untersuchung der Morphologie und der Beweglichkeit unter dem Mikroskop, Überimpfung auf einen nichtselektiven Blutagar, Oxidase-Test und Prüfung des aeroben Wachstums bei 25 °C (wahlweise Artidentifizierung mit biochemischen und/oder molekularen Tests). Aufgebracht werden 0,1 ml der Suspension je mCCDA-Platte, bei niedrigen Zahlen — 1,0 ml auf eine Platte von 140 mm oder auf drei Platten von 90 mm (im Doppelansatz: zwei große oder sechs gewöhnliche); wird nur die Erstverdünnung verwendet, so wird ein Doppelansatz hergestellt.
Wie groß sind Messbereich und Genauigkeit?
Nährmedium: modifizierter Kohle-Cefoperazon-Desoxycholat-Agar (mCCDA); Zusammensetzung und Leistungsprüfung — Anhang B; Bebrütung: 41,5 °C ± 1 °C, 44 h ± 4 h, mikroaerophile Atmosphäre (O₂ 5 ± 2 %, CO₂ 10 ± 3 %, wahlweise H₂ ≤ 10 %, Rest N₂); Inokulum: 0,1 ml je Platte von 90 mm; 1,0 ml auf eine Platte von 140 mm oder 3 × 90 mm (Doppelansätze) bei niedrigen Zahlen; Bestätigung: Morphologie und Beweglichkeit (Mikroskop, am besten Phasenkontrast), Überimpfung auf Blutagar, Oxidase +, kein aerobes Wachstum bei 25 °C; wahlweise Artidentifizierung (Biochemie, PCR — Amd 1:2023).
Wie lange dauert die Prüfung?
Das Verfahren umfasst 6 Schritte. Die Norm gibt nicht für jeden Schritt eine Dauer an — maßgeblich ist das Verfahren des Labors.
Welche Geräte werden benötigt?
Brutschränke 25 °C ± 1 °C, 37 °C ± 1 °C und 41,5 °C ± 1 °C, Gasdichte Töpfe mit Gasentwicklungssystemen oder Brutschrank mit Gasgemisch, Mikroskop mit Phasenkontrast, Sterile Petrischalen 90 mm und wahlweise 140 mm (am besten mit Belüftung), Impfösen 10 µl und 1 µl (keine Ni-Cr-Impföse für die Oxidase), Impfnadel, Wasserbad 37 °C ± 1 °C, Kühlschränke 3 °C ± 2 °C und 5 °C ± 3 °C.
Wo wird diese Prüfung eingesetzt?
Prozesshygienekriterium für Masthähnchenschlachtkörper nach dem Kühlen (Halshaut) — 1000 KBE/g, Referenzverfahren EN ISO 10272-2 (Verordnung 2073/2005 Pos. 2.1.9); Geflügelfleisch und anderes rohes Fleisch, Rohmilch; Proben aus der Primärproduktion — Kot, Staub, Abstriche in Geflügelbetrieben (Biosicherheit); Umgebungsproben aus Schlacht- und Zerlegebetrieben; Quantitative Untersuchungen in der Risikobeurteilung und zur Wirksamkeit von Interventionen (Kühlen, Waschen der Schlachtkörper).
Welche Sicherheitsmaßnahmen gelten?
Campylobacter ist ein Krankheitserreger des Menschen — Untersuchungen nur in entsprechend ausgestatteten Laboratorien unter der Aufsicht eines Mikrobiologen, sorgfältige Entsorgung der Materialien nach der Bebrütung; Gasentwicklungssysteme und Gemische mit Wasserstoff (≤ 10 %) — Vorgehen nach der Anweisung des Herstellers, gasdichte Töpfe; Cefoperazon und andere Antibiotika in den Supplementen — Staubbildung und Kontakt vermeiden.
Welches Labor führt diese Prüfung durch?
Die Prüfung führen nach ISO/IEC 17025 akkreditierte Labore durch. Auf LabCoda finden Sie sie über die Normnummer PN-EN ISO 10272-2.