🎨 Synthetische Lebensmittelfarbstoffe (HPLC)
Identifizierung und quantitative Bestimmung synthetischer Lebensmittelfarbstoffe (Tartrazin, Gelborange S, Azorubin, Allurarot AC u.a.) in Lebensmitteln mittels HPLC mit UV-Vis/DAD-Detektion.
Übersicht
Synthetische Lebensmittelfarbstoffe (E100–E199) gehören zu den am häufigsten kontrollierten Lebensmittelzusatzstoffen aufgrund potenzieller Gesundheitsrisiken — allergische Reaktionen, Hyperaktivität bei Kindern (sog. „Southampton Six") und mögliche karzinogene Wirkung einiger Azofarbstoffe. Die Verordnung (EG) 1333/2008 legt die zulässigen Farbstoffe und ihre Höchstmengen in den einzelnen Lebensmittelkategorien fest.
Die HPLC-Methode mit UV-Vis-Detektion (DAD — Diodenarray-Detektor) ist die analytische Referenztechnik zur gleichzeitigen Identifizierung und quantitativen Bestimmung mehrerer synthetischer Farbstoffe in einer einzigen Analyse. Die Umkehrphasen-Chromatographie (RP-HPLC) auf einer C18-Säule mit Gradientenelution ermöglicht die Trennung und quantitative Bestimmung aller zugelassenen synthetischen Farbstoffe in etwa 20–30 Minuten.
Die am häufigsten bestimmten Farbstoffe sind: Tartrazin (E102), Chinolingelb (E104), Gelborange S (E110), Azorubin (E122), Ponceau 4R (E124), Allurarot AC (E129), Brillantblau FCF (E133), Indigotin (E132) und Grün S (E142). Die Methode erfordert eine vorherige Extraktion der Farbstoffe aus der Lebensmittelmatrix, Aufreinigung auf SPE-Kartuschen und chromatographische Analyse.
Akkreditierte Laboratorien, die diese Untersuchungen durchführen, nehmen an Eignungsprüfungsprogrammen (PT) teil, die von FAPAS und LGC organisiert werden, was die Zuverlässigkeit der Ergebnisse auf internationalem Niveau gewährleistet.
Prinzip der Methode
Synthetische Farbstoffe werden mit einer Mischung aus Wasser/Methanol/Ammoniak aus der Lebensmittelprobe extrahiert, auf SPE-Kartuschen (Polyamid oder C18) aufgereinigt und mittels Flüssigchromatographie auf einer C18-Säule mit Gradientenelution (mobile Phase: Ammoniumacetatpuffer pH 7 / Acetonitril) getrennt. Die Detektion mittels DAD-Detektor (Diodenarray-Detektor) bei mehreren Wellenlängen (427 nm, 482 nm, 520 nm, 630 nm) ermöglicht die Identifizierung der Farbstoffe anhand des Absorptionsspektrums und der Retentionszeit. Die quantitative Bestimmung erfolgt über die Kalibrierkurve der Standards.
Anwendungen
- Amtliche Lebensmittelkontrolle durch die Lebensmittelüberwachung
- Qualitätskontrolle von kohlensäurehaltigen Getränken, Säften, Sirupen
- Untersuchung von Süßwaren, Bonbons, Gummibärchen auf Azofarbstoffe
- Analyse von Gewürzen und Saucen (Kurkumin vs. Tartrazin)
- Kontrolle von Kinderlebensmitteln (EU-Beschränkungen — zusätzliche Kennzeichnung)
- Untersuchung importierter Lebensmittel auf verbotene Farbstoffe (Sudan I–IV)
- Monitoring von Farbstoffen in Nahrungsergänzungsmitteln
Schlüsselparameter
| Parameter | Wert |
|---|---|
| Bestimmungsbereich | 0,5–500 mg/kg (abhängig von Farbstoff und Matrix) |
| Nachweisgrenze (LOD) | 0,1–0,5 mg/kg |
| Bestimmungsgrenze (LOQ) | 0,5–1,0 mg/kg |
| Säule | C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm) oder UHPLC C18 (100 × 2,1 mm, 1,8 µm) |
| Detektionswellenlängen | 427, 482, 520, 630 nm (DAD: Vollspektrum 200–700 nm) |
| Analysenzeit | 20–30 min (HPLC), 8–12 min (UHPLC) |
Norm
- Normnummer
- PN-EN 12878:2014 (oraz metody wewnętrzne oparte na HPLC-DAD)
- Titel (PL)
- Oznaczanie syntetycznych barwników w żywności metodą HPLC
- Title (EN)
- Determination of synthetic food colorants by HPLC
Schritt-für-Schritt-Verfahren
1. Probenvorbereitung
Lebensmittelprobe homogenisieren (Mixer). 2–5 g in einen Messkolben einwiegen.
2. Extraktion der Farbstoffe
20 mL Methanol/Wasser/Ammoniak-Mischung (70:25:5) hinzufügen. 15 min im Ultraschallbad behandeln. Filtrieren.
3. SPE-Aufreinigung
SPE-Kartusche konditionieren (5 mL Methanol, 5 mL Wasser). Extrakt auftragen. Mit 5 mL Wasser waschen. Elution der Farbstoffe mit 5 mL Methanol/Ammoniak.
4. Einengen und Lösen
Eluat unter Stickstoffstrom bei 40°C zur Trockne einengen. Rückstand in 1 mL mobiler Phase A lösen. Durch 0,22 µm in ein Vial filtrieren.
5. Standardvorbereitung
Kalibrierkurve (5 Punkte) aus zertifizierten Farbstoffstandards im Bereich 0,5–50 µg/mL erstellen.
6. HPLC-Analyse
10–20 µL Probe auf die C18-Säule injizieren. Gradientenelution: 0→50% ACN in Ammoniumacetatpuffer pH 7 in 25 min. Flussrate 1,0 mL/min.
7. Detektion und Identifizierung
Chromatogramm bei 427, 482, 520 und 630 nm aufzeichnen. Farbstoffe anhand der Retentionszeit und des UV-Vis-Absorptionsspektrums identifizieren (DAD-Spektrenbibliothek).
8. Quantitative Bestimmung
Farbstoffkonzentration aus der Kalibrierkurve berechnen. Verdünnungsfaktor und Wiederfindungsrate berücksichtigen.
9. Qualitätskontrolle
Blindprobe, dotierte Probe (Spike) und CRM analysieren. Wiederfindung 90–110%, Wiederholbarkeit RSD ≤ 5%.
10. Bericht
Prüfbericht erstellen mit Ergebnissen in mg/kg, Messunsicherheit und Vergleich mit Grenzwerten gemäß Verordnung 1333/2008.
Erforderliche Geräte und Apparatur
| Gerät | Beispiel | Richtpreis |
|---|---|---|
| HPLC-System mit DAD-Detektor | Agilent 1260 Infinity II + DAD G7117C, Shimadzu Nexera + SPD-M40, Waters Alliance + 2998 PDA | 150 000–350 000 PLN |
| Chromatographische Säule C18 | Agilent Zorbax Eclipse Plus C18, Waters Symmetry C18, Phenomenex Kinetex C18 | 1 500–3 500 PLN |
| SPE-System (Festphasenextraktion) | Manifold SPE Supelco Visiprep, Kartuschen Oasis HLB oder Polyamid | 2 000–5 000 PLN (Manifold) |
| Ultraschallbad | Bandelin Sonorex, Elma S, Branson 2800 | 3 000–8 000 PLN |
| Analysenwaage | Mettler Toledo MS205DU, RADWAG AS 220.R2 | 8 000–25 000 PLN |
Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien
| Reagenz | CAS | Details |
|---|---|---|
| Farbstoffstandards (zertifizierte CRM) | — | Tartrazin E102, Gelborange S E110, Azorubin E122, Ponceau 4R E124, Allurarot AC E129, Brillantblau E133 — Sigma-Aldrich, Dr. Ehrenstorfer |
| Acetonitril (HPLC-Reinheit) | 75-05-8 | Reinheit ≥ 99,9%, für mobile Phase und Extraktion |
| Methanol (HPLC-Reinheit) | 67-56-1 | Für die Extraktion der Farbstoffe aus der Lebensmittelmatrix |
| Ammoniumacetat | 631-61-8 | Zur Herstellung des Puffers der mobilen Phase (pH 7,0, Konzentration 0,02 mol/L) |
| Ammoniak 25% | 1336-21-6 | Zur Alkalisierung der Extraktionsphase — erleichtert das Lösen der Farbstoffe |
| SPE-Kartuschen (Polyamid/C18) | — | Zur Aufreinigung von Extrakten aus fett- und proteinhaltigen Matrices, 500 mg/6 mL |
Arbeitsschutz und Sicherheit
- Acetonitril — toxisch (Einatmen, Hautkontakt), unter dem Abzug arbeiten
- Methanol — toxisch, leichtentzündlich (Flammpunkt 11°C) — Abzug, kein offenes Feuer
- Ammoniak — ätzend, Atemwegsreizung — Abzug, Schutzbrille, Handschuhe
- Farbstoffstandards — einige Azofarbstoffe können sensibilisierend wirken, Handschuhe verwenden
- HPLC-Abfälle (mobile Phase) — in Behältern für organische Abfälle sammeln