🦠 Validierung von Verfahren zur Anreicherung von Bakteriophagen aus Wasser (wenn weniger als 3 plaquebildende Partikel je ml erwartet werden) — Dotiermaterial aus behandeltem oder rohem Abwasser (Zentrifugation bei 1000 g für 20 min oder Filtration durch 8–12 µm, 60–200 pfp/ml, 5 % Glycerin, 10-ml-Portionen bei −20 oder −70 °C eingefroren), geprüft mit den Dispersionstests T1 (0,01 < T1 < 5,99) und T2 (< 3,84); für jede Wasserart mindestens fünf Proben an verschiedenen Tagen und Jahreszeiten, Volumina 0,125, 0,25, 0,5 und 1 × Vmax mit je 1 ml Material dotiert, Wiederfindung im gesamten Endkonzentrat, Dixon-Test für Ausreißer; Phagenzählung nach ISO 10705-1, -2 oder -4; PN-EN ISO 10705-3:2025-06

Mikrobiologie PN-EN ISO 10705-3

Übersicht

WAS DIE NORM BESCHREIBT. Den Normtext lesen wir in der iTeh-Leseprobe von ISO 10705-3:2003 (erste Ausgabe vom 01.10.2003, französische Fassung) — PN-EN ISO 10705-3:2025-06 übernimmt EN ISO 10705-3:2024 und ISO 10705-3:2003 als identisch (PKN-Suche), der gelesene ISO-Text ist also der geltende: Vorwort, Abschnitte 1–8 und Abschnitt 9 bis zum Ende von 9.2 — die Leseprobe endet auf Seite 5. Berechnungen (10), analytische Qualitätskontrolle (11), Prüfbericht (12), Anhang A (empfohlene Anreicherungsverfahren je nach Volumen, Trübung und Partikelgehalt) und Anhang B (Validierungsbeispiel) lesen wir nicht; ihre Titel kennen wir aus dem Inhaltsverzeichnis. Das Titelblatt von EN ISO 10705-3:2024 haben wir nicht gelesen.

NACH DEM TEXT VON ISO 10705-3:2003. Die Norm wurde von ISO/TC 147 „Wasserbeschaffenheit“, Unterkomitee SC 4 „Mikrobiologische Verfahren“, erarbeitet. Reihe ISO 10705: Teil 1 — F-spezifische RNA-Bakteriophagen, Teil 2 — somatische Coliphagen, Teil 3 — Validierung von Anreicherungsverfahren, Teil 4 — Bakteriophagen, die Bacteroides fragilis infizieren. Warnhinweis: der Anwender legt Arbeitsschutzmaßnahmen fest; wichtig: Personal, das Anreicherungsverfahren validiert, muss Erfahrung mit Verfahren zur Zählung von Bakteriophagen haben (ISO/TR 13843). Anwendungsbereich (1): allgemeine Grundsätze zur Beurteilung der Leistungsfähigkeit von Verfahren zur Anreicherung von Bakteriophagen aus Wasser; Anreicherung wird für Proben empfohlen, in denen weniger als 3 plaquebildende Partikel (pfp) je Milliliter erwartet werden; die Verfahren sind auf alle Wasserarten anwendbar, sofern Menge und Art suspendierter oder gelöster Stoffe die Anreicherung nicht stören; die Norm beschreibt keine Verfahren im Einzelnen, nur die Grundsätze zur Beurteilung der Eignung eines Verfahrens für eine Wasserart und ein Volumen; Beispiele bewährter Verfahren enthält Anhang A. Verweisungen (2): ISO 3696, ISO 6887-1, ISO 8199, ISO 10705-1, -2, -4, ISO/IEC Guide 2. Begriff (3.1): Bakteriophagen — bakterielle Viren, die ausgewählte Wirtsstämme infizieren können; Anmerkung: sie bilden sichtbare Plaques (Lysezonen) in einem geschlossenen Rasen des Wirtsstamms. Prinzip (4): die Probe wird mit einem gewählten Verfahren behandelt, das Bakteriophagen aus einem großen Volumen (100 ml bis mehrere Liter) auf ein kleines (wenige bis 20 ml) anreichert; das Konzentrat wird nach einem genormten Verfahren oder einem anderen geeigneten Protokoll untersucht; das Anreicherungsverfahren wird in einem Protokoll genau beschrieben (möglichst im Aufbau von ISO-Normen), einschließlich Zielphagengruppen und ihrer Nachweisverfahren, Wasserarten, Volumenbereich und Ausnahmen, z. B. Trübung; die Validierung besteht in der Bestimmung der Wiederfindung von Bakteriophagen aus einer Reihe von Proben, die mit natürlich verunreinigtem Wasser (rohem oder behandeltem Abwasser) dotiert sind, über einen Volumenbereich, mit besonderer Beachtung der Reproduzierbarkeit der Wiederfindung. Reagenzien (5): Bestandteile gleichbleibender Qualität und Chemikalien analytischer Reinheit; in Glas destilliertes oder entionisiertes Wasser ohne wachstumshemmende Stoffe, mindestens Qualität 3 (ISO 3696); Verdünnungsmittel — Pepton-Kochsalzlösung oder ein anderes nach ISO 6887-1 oder ISO 8199; Nährmedien und Referenzkulturen nach dem jeweiligen Phagenzählverfahren (ISO 10705-1, -2, -4); Glycerin (870 g/l), 15 min bei (121 ± 3) °C autoklaviert, im Dunkeln bei Raumtemperatur höchstens ein Jahr. Geräte (6): Sicherheitsvorkehrungen — Feldgeräte werden vor Gebrauch desinfiziert; manche Schritte erfordern hydrostatischen oder pneumatischen Druck; übliche mikrobiologische Ausrüstung nach Zählverfahren und Anreicherungsprotokoll. Probenahme (7): Proben bis 10 l lassen sich leicht ins Labor transportieren — Probenahme und Transport nach ISO 8199 (auch ISO 19458); bei größeren Volumina wird der erste Anreicherungsschritt vorzugsweise vor Ort durchgeführt (kann mehrere Stunden dauern); werden parallel bakterielle Indikatoren untersucht, wird eine proportionale Probe entnommen, vorzugsweise aus einem Seitenstrom der Anreicherungsapparatur; Filter, Niederschläge oder andere Produkte des ersten Schritts können vor Ort weiterverarbeitet oder transportiert werden; Transport- und Lagerbedingungen der Zwischenschritte werden in die Validierung einbezogen. Dotiermaterial (8): eine Probe von primär oder sekundär (biologisch) behandeltem Abwasser wird 20 min bei 1000 g zentrifugiert oder durch eine 8–12-µm-Membran filtriert; Überstand oder Filtrat in schmelzendem Eis; Zielphagen werden in 1-ml-Volumina gezählt und die Probe ggf. auf 60–200 pfp/ml verdünnt; Glycerin bis 5 % (Volumenanteil) zugeben, mischen, in 10-ml-Portionen in Glas- oder Kunststoffflaschen (oder Röhrchen, Fläschchen) abfüllen und bei (−20 ± 5) °C oder (−70 ± 10) °C einfrieren; zwei Flaschen bei Raumtemperatur auftauen und aus jeder zwei 0,5-ml-Portionen untersuchen — der Mittelwert soll in den Grenzen liegen (30–100 pfp); die Homogenität innerhalb und zwischen Flaschen wird mit Cochran-Dispersionsstatistiken geprüft: T1 (Streuung innerhalb eines Fläschchens, I(J−1) Freiheitsgrade) und T2 (Streuung zwischen Fläschchen, I−1 Freiheitsgrade), mit I = 2 Fläschchen und J = 2 Wiederholungen; bei zufälliger Verteilung folgen T1 und T2 näherungsweise einer χ²-Verteilung mit 2 und 1 Freiheitsgrad; das Material ist annehmbar bei 0,01 < T1 < 5,99 und T2 < 3,84; Anmerkung: in teilweise gereinigtem Abwasser natürlich vorhandene somatische Coliphagen, F-spezifische RNA-Bakteriophagen und Bacteroides-fragilis-Phagen werden beim Einfrieren mit 5 % Glycerin nicht wesentlich inaktiviert und können unter (−20 ± 5) °C, vorzugsweise bei (−70 ± 10) °C, mindestens ein Jahr ohne wesentliche Abnahme gelagert werden. Chargenverfahren (9.1.1): Proben aller Wasserarten des Anwendungsbereichs, an verschiedenen Tagen entnommen, vorzugsweise verschiedene Jahreszeiten und Witterungen repräsentierend; mindestens fünf Proben je Wasserart; Vmax — größtes vom Verfahren zu bearbeitendes Volumen; benötigt werden mindestens 3 × Vmax Probe; Gefäße mit 0,125, 0,250, 0,500 und 1 × Vmax, jedes mit 1 ml auf Raumtemperatur erwärmtem Dotiermaterial, Rest in Eis. Kontinuierliche Verfahren (9.1.2): Feldstudien für jede Wasserart an verschiedenen Tagen, mindestens fünf Proben, dieselben Volumina; 1 ml Material in etwa 10 ml Verdünnungsmittel wird in den Zulauf der Apparatur injiziert (z. B. mit einer Spritzennadel durch einen Schlauch), in vier ähnlichen Portionen, jeweils nach Durchlauf etwa eines Fünftels des Volumens. Wiederfindung (9.2): dotierte Proben werden nach Protokoll verarbeitet, einschließlich Transport und Lagerung wie bei realen Proben; das gesamte Endkonzentrat wird in Portionen von 1 ml oder weniger untersucht; nach Möglichkeit auch auf Anreicherungsflächen zurückgehaltene Phagen, z. B. auf Filtern; parallel zwei 0,5-ml-Portionen Dotiermaterial — zur Berechnung der Anreicherungseffizienz und von T1, T2; erfüllen mehr als 20 % (1 von 5) der Dotiermaterialproben T1 oder T2 nicht, wird das Material verworfen; bei 20 % oder weniger wird das Ergebnis dieser Analyse verworfen und wiederholt; Ausreißer werden mit dem Dixon-Test verworfen; mindestens fünf Versuche mit nicht verworfenen Ergebnissen; kann das natürliche Wasser Phagen enthalten, die mit demselben Wirt nachgewiesen werden, werden sie gezählt — bei > 20 % der zugegebenen Phagen wird das Wasser 30 min auf 80 °C erhitzt und abgekühlt; bei < 20 % werden sie gezählt und in der Auswertung berücksichtigt (10).

STATUS (Stand 03.10.2026). Die PKN-Suche (Suchbegriff „10705-3“, 03.10.2026) liefert drei Ergebnisse: PN-EN ISO 10705-3:2025-06 — polnische und englische Fassung, „Übernimmt: EN ISO 10705-3:2024 [IDT], ISO 10705-3:2003 [IDT]“, ohne Zurückziehungsvermerk; sowie PN-ISO 10705-3:2021-01 (polnische Fassung) — „Zurückgezogen und ersetzt durch PN-EN ISO 10705-3:2025-06 - englische Fassung“. Datensatz von PN-ISO 10705-3:2021-01 (gelesen 03.10.2026): Veröffentlichung 27-01-2021, Zurückziehung 13-06-2025, übernimmt ISO 10705-3:2003 [IDT], KT 120 „Wasserbeschaffenheit — mikrobiologische und biologische Prüfungen“, ersetzt durch PN-EN ISO 10705-3:2025-06 (englische Fassung). Was die Zurückziehung für das Ergebnis ändert: beide Normen übernehmen denselben Text ISO 10705-3:2003 (die neue über EN ISO 10705-3:2024), die Validierungsgrundsätze bleiben also gleich; es ändert sich die Dokumentbezeichnung, die im Umfang und im Bericht stehen sollte.

WIE VIELE LABORATORIEN UND IN WELCHER FORM (Kopie der Datenbank der Akkreditierungsumfänge, Stand bis 17.09.2026, gelesen 03.10.2026). Die Nummer 10705-3 steht in 2 Datensätzen bei 2 Laboratorien: AB 700 und AB 1095. In den aktuellen PCA-Dokumenten (gelesen 03.10.2026; AB 1095 Ausgabe Nr. 25 vom 03.07.2026, AB 700 Ausgabe Nr. 33 vom 21.08.2026) steht die Nummer bei denselben 2 Laboratorien; in jedem Dokument entspricht die Zahl der Seitenmarken der Zahl der PDF-Seiten, ohne Duplikate; die Durchsuchung aller am 03.10.2026 aus dem BIP geladenen PCA-Dokumente ergab keine Laboratorien außerhalb der Datenbankkopie. Schreibweisen: „PN-EN ISO 10705-3:2025-06“ (AB 700) und „PN-ISO 10705-3:2021-01“ (AB 1095 — am 13.06.2025 zurückgezogene Ausgabe), bei beiden zusammen mit PN-EN ISO 10705-2:2005. Keine dieser Positionen ist ausgesetzt. Der Reiter „Laboratorien“ zeigt AB 700 unter „PN-EN ISO 10705-3“ und AB 1095 unter „PN-ISO 10705-3“ — geprüft per Abfragen des Reiters auf dem Produktionsserver labcoda.pl am 03.10.2026.

WAS DIE LABORATORIEN PRÜFEN (PCA-Positionen). AB 700: Wasser, Wasser für den menschlichen Gebrauch, Abwasser — Anzahl somatischer Coliphagen, Plattenverfahren (Gussplatte), PN-EN ISO 10705-2:2005 und PN-EN ISO 10705-3:2025-06. AB 1095: Wasser, Wasser für den menschlichen Gebrauch — Anzahl somatischer Coliphagen, Plattenverfahren (Gussplatte), PN-EN ISO 10705-2:2005 und PN-ISO 10705-3:2021-01. Die Zählung somatischer Coliphagen nach PN-EN ISO 10705-2 hat einen eigenen Eintrag in der Wissensdatenbank.

WO LEICHT EIN SCHEINBAR RICHTIGES ERGEBNIS ENTSTEHT. Charakter der Norm: sie ist kein Anreicherungsverfahren, sondern regelt dessen Validierung — das konkrete Verfahren beschreibt das Laborprotokoll, Beispiele enthält Anhang A (1, 4). Anwendung: Anreicherung wird empfohlen, wenn weniger als 3 pfp/ml erwartet werden (1); die Validierung umfasst die Wasserarten und den Volumenbereich des Protokolls, Ausnahmen (z. B. Trübung) sind darin zu beschreiben (4). Dotiermaterial: im Abwasser natürlich vorhandene Phagen; Homogenität per T1 und T2, bei mehr als 20 % Nichterfüllung wird das Material insgesamt verworfen (8, 9.2). Proben: mindestens fünf je Wasserart, an verschiedenen Tagen und möglichst Jahreszeiten, in vier Volumina bis Vmax (9.1). Wiederfindung: das gesamte Konzentrat wird untersucht und nach Möglichkeit auf Filtern zurückgehaltene Phagen (9.2). Natürliche Phagen: über 20 % der zugegebenen — Wasser 30 min auf 80 °C erhitzen (9.2). Transport: Transport- und Lagerbedingungen der Zwischenschritte gehören zur Validierung (7). Ausgabe: AB 1095 verweist auf die am 13.06.2025 zurückgezogene PN-ISO 10705-3:2021-01 — der fachliche Text ist derselbe (ISO 10705-3:2003).

WAS WIR NICHT ANGEBEN. Formeln zur Berechnung der Wiederfindung (10), Anforderungen an die Qualitätskontrolle (11), Inhalt des Berichts (12) sowie die Verfahren in Anhang A und das Beispiel in Anhang B geben wir nicht wieder — sie liegen außerhalb der Leseprobe. ISO 10705-1, -2 und -4 fassen wir in diesem Eintrag nicht zusammen.

Prinzip der Methode

Ein Anreicherungsverfahren, das Bakteriophagen aus einem großen Wasservolumen (100 ml bis mehrere Liter) in wenige Milliliter überführen soll, wird über seine Wiederfindung geprüft. Aus im Abwasser natürlich vorhandenen Phagen wird ein Dotiermaterial hergestellt, mit Glycerin eingefroren und auf Homogenität geprüft (Tests T1 und T2). Je 1 ml Material wird einer Reihe von Volumina des untersuchten Wassers (bis zum Höchstvolumen des Verfahrens) zugesetzt, die Proben werden nach Protokoll angereichert und die Phagen im gesamten Konzentrat mit einem genormten Zählverfahren bestimmt; die in mindestens fünf Proben jeder Wasserart wiederholte Wiederfindung zeigt die Eignung des Verfahrens.

Anwendungen

• Wässer mit geringer Bakteriophagenzahl (< 3 pfp/ml), die eine Anreicherung erfordern (1)
• Validierung von Chargen-Anreicherungsverfahren (Proben in Gefäßen) und kontinuierlichen Verfahren (Durchfluss durch die Apparatur im Feld) (9.1)
• Somatische Coliphagen, F-spezifische RNA-Bakteriophagen und Bacteroides-fragilis-Phagen — Zählung nach ISO 10705-1, -2, -4 (2, 5.3)
• Wasser, Wasser für den menschlichen Gebrauch und Abwasser — Anzahl somatischer Coliphagen (mit PN-EN ISO 10705-2) — 2 Datensätze von Akkreditierungsumfängen von 2 Laboratorien in PCA

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 10705-3:2025-06

Titel (PL)

Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie liczby bakteriofagów — Część 3: Walidacja metod zatężania bakteriofagów z wody

Title (EN)

Water quality — Detection and enumeration of bacteriophages — Part 3: Validation of methods for concentration of bacteriophages from water

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Protokoll des Anreicherungsverfahrens

   Phagengruppen, Nachweisverfahren, Wasserarten, Volumina und Ausnahmen (4). PN-EN ISO 10705-3:2025-06 — ohne Zurückziehungsvermerk (PKN, 03.10.2026).

2. Dotiermaterial

   Partikelbefreites Abwasser, 60–200 pfp/ml, 5 % Glycerin, 10-ml-Portionen eingefroren; Prüfung T1, T2 (8).

3. Dotierte Proben

   ≥ 5 Proben je Wasserart, vier Volumina bis Vmax, je 1 ml Material (9.1).

4. Anreicherung und Zählung

   Nach Protokoll einschließlich Transport und Lagerung; gesamtes Konzentrat, auch Phagen auf Filtern (9.2).

5. Auswertung

   Materialprüfung (T1, T2), Dixon-Test, natürliche Phagen; Berechnungen — außerhalb der Leseprobe (9.2, 10).

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Feldgeräte werden vor Gebrauch desinfiziert, mit den für das Desinfektionsmittel geeigneten Sicherheitsvorkehrungen (6)
• Schritte unter hydrostatischem oder pneumatischem Druck erfordern geeignete Sicherheitsvorkehrungen (6)

Häufige Fragen