🦠 Aerobe mesophile Bakterien in kosmetischen Mitteln — Koloniezählverfahren auf SCDA/TSA-Agar (32,5 °C, 72 h) oder Nachweis nach Anreicherung

Mikrobiologie PN-EN ISO 21149

Übersicht

ISO 21149:2017 gibt allgemeine Leitlinien für das Zählen und den Nachweis aerober mesophiler Bakterien in kosmetischen Mitteln an: durch das Zählen der Kolonien auf einem Agarmedium nach aerober Bebrütung oder durch die Prüfung auf das Ausbleiben des Bakterienwachstums nach einer Anreicherung. Wegen der Vielfalt der Erzeugnisse kann das Verfahren nicht in jeder Einzelheit geeignet sein (z. B. für nicht mit Wasser mischbare Erzeugnisse); andere Verfahren (z. B. automatische) dürfen nach dem Nachweis der Gleichwertigkeit angewendet werden. Bei Bedarf werden die gezählten oder nachgewiesenen Mikroorganismen mit Tests aus den im Literaturverzeichnis genannten Normen identifiziert. Die Norm empfiehlt eine mikrobiologische Risikoanalyse, um festzulegen, auf welche Erzeugnisse sie anzuwenden ist; Erzeugnisse mit geringem Risiko (ISO 29621) sind solche mit niedriger Wasseraktivität, hydroalkoholische, solche mit extremem pH-Wert usw.

Das Verfahren enthält drei Varianten: das Plattenzählverfahren, die Membranfiltration und den Nachweis nach Anreicherung. In jeder muss eine etwaige Hemmung des Wachstums durch das Erzeugnis neutralisiert und die Wirksamkeit der Neutralisation überprüft und nachgewiesen werden. In Polen gilt sie als PN-EN ISO 21149:2017-07 mit der Änderung A1:2023-01. Die Laboratorien, die kosmetische Mittel untersuchen, wenden sie zur Bestimmung der „aeroben mesophilen Mikroorganismen" auf TSA-Agar (Bakterien) an, parallel zu PN-EN ISO 16212 auf SDA-Agar (Pilze).

Prinzip der Methode

Plattenzählverfahren: Herstellung von Platten im Plattenguss- oder im Oberflächenverfahren auf einem festgelegten Nährmedium und Beimpfung mit einer festgelegten Menge der Erstverdünnung oder ihrer Verdünnung; aerobe Bebrütung bei (32,5 ± 2,5) °C 72 h ± 6 h; Zählen der koloniebildenden Einheiten (KBE) und Berechnung der Zahl der aeroben mesophilen Bakterien je Milliliter oder Gramm des Erzeugnisses. Membranfiltration: Eine geeignete Menge der vorbereiteten Probe wird in die mit sterilem Verdünnungsmittel benetzte Filtrationsapparatur überführt, sofort filtriert und gewaschen, und das Filter wird auf die Oberfläche des Agarmediums überführt (nach ISO 21148); Bebrütung wie oben. Nachweis nach Anreicherung: Bebrütung einer festgelegten Menge der Erstverdünnung in einem nichtselektiven flüssigen Nährmedium mit Neutralisatoren und/oder Dispergiermitteln bei (32,5 ± 2,5) °C über mindestens 20 h, Überführung einer festgelegten Menge auf einen nichtselektiven Agar, aerobe Bebrütung 48–72 h bei derselben Temperatur und Ergebnis als Anwesenheit/Fehlen aerober mesophiler Bakterien in der Probe S des Erzeugnisses. Nährmedien: neutralisierendes Verdünnungsmittel SCDLP 20 (pankreatisch verdautes Casein 20,0 g, Sojalecithin 5,0 g, Polysorbat 20 40,0 ml, Wasser 960 ml; das Polysorbat wird im Bad bei (49 ± 2) °C gelöst, nach der Zugabe der Bestandteile wird etwa 30 min erwärmt; Sterilisation 121 °C, 15 min), Casein-Soja-Agar (SCDA) oder Trypton-Soja-Agar (TSA) für das Zählen, Eugon-LT-100-Bouillon und -Agar für den Nachweis.

Anwendungen

• Routinekontrolle der mikrobiologischen Reinheit kosmetischer Mittel — Zahl der aeroben mesophilen Bakterien (KBE/g, KBE/ml)
• Erzeugnisse mit hohem mikrobiologischem Risiko auf Wasserbasis (Gele, Cremes, Lotionen) — Chargenfreigabe
• Erzeugnisse, für die nur das Ergebnis „Anwesenheit/Fehlen" gefordert ist — Variante mit Anreicherung
• Erzeugnisse mit niedriger Bakterienzahl oder schwierig im Plattenverfahren auszubringende Erzeugnisse — Membranfiltration
• Untersuchungen der Wirksamkeit der Konservierung (Belastungstest) — Zählen der überlebenden Bakterien

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN ISO 21149:2017-07 + A1:2023-01 (ISO 21149:2017 + Amd 1:2022)

Titel (PL)

Kosmetyki — Mikrobiologia — Zliczanie i wykrywanie mezofilnych bakterii tlenowych

Title (EN)

Cosmetics — Microbiology — Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Erstverdünnung

   Entnimm mindestens 1 g oder 1 ml des Erzeugnisses und stelle die Erstverdünnung in einem neutralisierenden Verdünnungsmittel (z. B. SCDLP 20) mit einem etwaigen Dispergiermittel her; bereite die Verdünnungen vor.

2. Prüfung der Neutralisation

   Prüfe die Wirksamkeit der Neutralisation der antibakteriellen Eigenschaften des Erzeugnisses und weise sie nach (in jeder Variante des Verfahrens gefordert).

3. Variante A — Plattenzählverfahren

   Bringe eine festgelegte Menge der Erstverdünnung oder einer Verdünnung im Plattenguss- oder im Oberflächenverfahren auf Casein-Soja-Agar (SCDA/TSA) aus.

4. Variante B — Membranfiltration

   Überführe eine geeignete Menge der Probe in die mit sterilem Verdünnungsmittel benetzte Filtrationsapparatur, filtriere sofort, wasche nach dem Verfahren und überführe das Filter auf die Oberfläche des Agars (ISO 21148).

5. Bebrütung und Zählen

   Bebrüte aerob bei (32,5 ± 2,5) °C 72 h ± 6 h; zähle die KBE und berechne die Zahl der aeroben mesophilen Bakterien je ml oder g des Erzeugnisses.

6. Variante C — Nachweis nach Anreicherung

   Bebrüte eine festgelegte Menge der Erstverdünnung in einer nichtselektiven Bouillon mit Neutralisatoren (Eugon LT 100) bei (32,5 ± 2,5) °C mindestens 20 h, überführe eine festgelegte Menge auf einen nichtselektiven Agar und bebrüte aerob 48–72 h; beurteile das Wachstum.

7. Ergebnis

   Gib KBE/ml oder KBE/g des Erzeugnisses oder die Anwesenheit/das Fehlen aerober mesophiler Bakterien in der Probe S an; identifiziere bei Bedarf die Isolate.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Bakterienkulturen unbekannter Zugehörigkeit — Arbeit unter den Bedingungen eines mikrobiologischen Labors, Autoklavieren der Abfälle
• Heiße Nährmedien (Bad 49 °C, Autoklav 121 °C) — Verbrennungsgefahr
• Membranfiltration unter Vakuum — einwandfreie Glasgeräte

Häufige Fragen