🦠 Coliforme Bakterien in Lebensmitteln — Nachweis und MPN-Bestimmung in Lauryltryptose-Bouillon

Mikrobiologie PN-ISO 4831

Übersicht

ISO 4831:2006 gibt allgemeine Leitlinien für den Nachweis und die Bestimmung der Zahl der coliformen Bakterien in Erzeugnissen für Menschen und Tiere sowie in Umgebungsproben aus der Herstellung und dem Verkehr mit Lebensmitteln an; die Zahl wird als wahrscheinlichste Keimzahl (MPN) nach der Bebrütung in einem flüssigen Nährmedium bei 30 °C oder 37 °C bestimmt (die Temperatur ist zu vereinbaren; Milch und Milcherzeugnisse — 30 °C). Das Bestimmungsverfahren ist anwendbar, wenn die erwartete Zahl 1–100 je ml oder g beträgt. Es ist weniger präzise als das Plattenzählverfahren nach ISO 4832, erlaubt aber, eine größere Portion zu untersuchen und kleinere Bakterienzahlen je Gramm nachzuweisen; die Definitionen der „coliformen Bakterien" sind in beiden Normen verschieden. Die coliformen Bakterien werden hier als Bakterien definiert, die bei der vereinbarten Temperatur Lactose unter Gasbildung vergären; ein Teil der als coliform beschriebenen Stämme (darunter E. coli) bildet nicht genug Gas, um es im Durham-Röhrchen nachzuweisen (anaerogene Stämme), sodass das Verfahren nicht alle „präsumtiven Coliformen" erfasst (z. B. manche Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella). Eine Einschränkung ist die große Streuung des Verfahrens (Abschn. 11). In den Skripten der UWM ist dasselbe Verfahren als dreiröhrige MPN-Bestimmung in einem Nährmedium mit Natriumlaurylsulfat (30 °C/48 h) mit der Bestätigung in einem Nährmedium mit Lactose, Galle und Brillantgrün beschrieben.

Prinzip der Methode

Nachweis: Ein Röhrchen der selektiven Anreicherungsbouillon wird mit einer Portion der Probe beimpft und bei 30 °C oder 37 °C 24 h oder 48 h bebrütet; aus den Röhrchen mit Trübung oder Gas wird in das Bestätigungsnährmedium überimpft (24 h oder 48 h); die Anwesenheit der Coliformen bestätigen Trübung und Gas. MPN-Bestimmung: Drei Röhrchen der doppelt konzentrierten Bouillon werden mit einer festgelegten Menge der flüssigen Probe oder der Erstverdünnung beimpft, drei Röhrchen der einfach konzentrierten — mit derselben Menge, und die weiteren einfach konzentrierten Röhrchen — mit den Zehnerverdünnungen; die doppelt konzentrierten werden 24 h, die einfach konzentrierten 24 h oder 48 h bebrütet, wonach auf Gas oder auf eine Trübung, die dessen Feststellung unmöglich macht, geprüft wird; aus den doppelt konzentrierten Kulturen und aus den einfach konzentrierten mit Gas/Trübung wird in die Bestätigungsbouillon überimpft, 24 h oder 48 h bebrütet, und aus der Zahl der Röhrchen mit Gas wird die MPN aus der Tabelle abgelesen. Lauryltryptose-Bouillon (LST): Hydrolysat von Milch- und tierischen Proteinen 20 g (40 g in der doppelt konzentrierten), Lactose 5 g (10 g), K₂HPO₄ 2,75 g (5,5 g), KH₂PO₄ 2,75 g (5,5 g), NaCl 5 g (10 g), Natriumlaurylsulfat 0,1 g (0,2 g) je 1000 ml; pH 6,8 ± 0,2; zu je 10 ml in Röhrchen 16 × 160 mm mit Durham-Röhrchen (einfach konzentriert) oder 20 × 200 mm ohne Durham-Röhrchen (doppelt konzentriert); 121 °C 15 min. Bestätigungsbouillon: Caseinhydrolysat 10 g, Lactose 10 g, getrocknete Rindergalle 20 g, Brillantgrün 0,0133 g/l; pH 7,2 ± 0,2; 10 ml mit Durham-Röhrchen. Nach der Sterilisation dürfen die Durham-Röhrchen keine Luftbläschen enthalten.

Anwendungen

• Nachweis der Anwesenheit coliformer Bakterien in einer festgelegten Menge des Erzeugnisses (z. B. 1 g/1 ml) — Hygienekontrolle in den Betrieben
• Bestimmung kleiner Zahlen der Coliformen (1–100 KBE/g) in Milch und Milcherzeugnissen (30 °C), Speiseeis, Feinkosterzeugnissen
• Umgebungsproben aus den Bereichen der Herstellung und des Verkehrs mit Lebensmitteln
• Futtermittel und Rohstoffe, wenn das Plattenzählverfahren zu wenig empfindlich ist
• Zusätzliche Kriterien in Werknormen und Abnehmerspezifikationen

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-ISO 4831:2007 (ISO 4831:2006)

Titel (PL)

Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby bakterii z grupy coli — Metoda najbardziej prawdopodobnej liczby

Title (EN)

Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection and enumeration of coliforms — Most probable number technique

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Probe

   Bereite die Probe, die Erstverdünnung und die Zehnerverdünnungen nach ISO 6887 (zutreffender Teil), ISO 8261 oder der Norm für das Erzeugnis vor.

2. Nachweis — Beimpfen

   Überführe je nach der geforderten Nachweisgrenze x ml der Probe oder der Erstverdünnung in 10 ml der doppelt konzentrierten (1 ml < x < 10 ml) oder der einfach konzentrierten Bouillon (x ≤ 1 ml); bebrüte 24 h ± 2 h (doppelt konzentriert) oder 24 h ± 2 h und bei fehlendem Gas/fehlender Trübung weitere 24 h ± 2 h (einfach konzentriert).

3. Nachweis — Bestätigung

   Überimpfe aus dem doppelt konzentrierten Röhrchen sowie aus den einfach konzentrierten Röhrchen mit Gas oder Trübung mit der Impföse in die Bestätigungsbouillon; bebrüte 24 h ± 2 h, bei fehlendem Gas bis 48 h ± 2 h; ein Röhrchen mit Gas = positiv (Anwesenheit der Coliformen in x g/ml).

4. MPN — Beimpfen

   Beimpfe drei Röhrchen der doppelt konzentrierten und drei der einfach konzentrierten Bouillon mit einer festgelegten Menge der Probe oder der Erstverdünnung und die weiteren Dreiergruppen einfach konzentrierter Röhrchen mit den Zehnerverdünnungen (mindestens drei aufeinanderfolgende Verdünnungen).

5. MPN — Bebrütung und Überimpfung

   Bebrüte wie oben; überimpfe aus den doppelt konzentrierten Kulturen und aus den einfach konzentrierten mit Gas oder mit einer Trübung, die die Feststellung des Gases unmöglich macht, in die Bestätigungsbouillon und bebrüte 24 h oder 48 h.

6. Ablesen der MPN

   Lies aus der Zahl der Bestätigungsröhrchen mit Gas in jeder Reihe die MPN je ml oder g aus der Tabelle ab; berücksichtige bei der Auslegung die Streuung des Verfahrens (Abschn. 11); gib im Prüfbericht die Bebrütungstemperatur und die Abweichungen an.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Die Kulturen können pathogene Enterobacteriaceae enthalten — Arbeit unter den Bedingungen eines mikrobiologischen Labors, Autoklavieren der Abfälle
• Brillantgrün und Gallensalze — Staubentwicklung beim Einwiegen vermeiden
• Durham-Röhrchen — Vorsicht beim Öffnen der Röhrchen mit Gas

Häufige Fragen