🦠 Coliforme Bakterien in Lebensmitteln — Plattenzählverfahren (Plattengussverfahren auf VRBL-Agar)

Mikrobiologie PN-ISO 4832

Übersicht

ISO 4832:2006 gibt allgemeine Leitlinien für die Bestimmung der Zahl der coliformen Bakterien in Erzeugnissen an, die für Menschen und Tiere bestimmt sind, sowie in Umgebungsproben aus der Herstellung und dem Verkehr mit Lebensmitteln, und zwar durch das Zählen der Kolonien nach der Bebrütung auf einem festen Nährmedium bei 30 °C oder 37 °C (die Temperatur ist zwischen den Parteien zu vereinbaren; für Milch und Milcherzeugnisse 30 °C). Die Technik wird empfohlen, wenn die erwartete Zahl der Kolonien 100 je ml oder g übersteigt. Sie ist präziser als das MPN-Verfahren nach ISO 4831, erlaubt aber nicht, eine so große Portion zu untersuchen, weshalb man sie bei einer hohen Bakterienzahl bevorzugt; die Definitionen der „coliformen Bakterien" sind in beiden Normen verschieden, sodass die bestimmten Mikroorganismen nicht dieselben sein müssen. Die coliformen Bakterien werden hier als Bakterien definiert, die bei der vereinbarten Temperatur auf dem Agar mit Kristallviolett, Neutralrot, Galle und Lactose charakteristische Kolonien bilden und im Bestätigungstest Lactose unter Gasbildung vergären; das Verfahren erfasst im Mittel etwa 90 % der Stämme, die in anderen Veröffentlichungen als „präsumtive Coliforme" beschrieben werden (z. B. manche Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella). Präzision: bei der Poisson-Verteilung Vertrauensgrenzen ± 16 % bis ± 52 %; in Ringversuchen sr = 0,20 log, sR = 0,35 log. In akademischen Skripten (UWM, Universität Ermland-Masuren in Olsztyn) erscheint dieses Verfahren als „zusätzliches Kriterium", das von den Lebensmittelherstellern bestimmt wird: Beimpfen des VRBL-Agars, 37 °C/24 h, Zählen der dunkelpurpurroten, von einem roten Hof umgebenen Kolonien.

Prinzip der Methode

Es werden zwei Platten im Plattengussverfahren mit einer festgelegten Menge der Probe (flüssiges Erzeugnis) oder der Erstverdünnung hergestellt sowie weitere Plattenpaare aus den Zehnerverdünnungen; die Platten werden 24 h bei 30 °C oder 37 °C bebrütet; die charakteristischen Kolonien werden gezählt und, falls nötig, wird die Lactosevergärung bestätigt; die Zahl der Bakterien je ml oder g wird nach ISO 7218 berechnet. Das VRBL-Nährmedium (Agar mit Kristallviolett, Neutralrot, Galle und Lactose): enzymatisches Hydrolysat tierischer Gewebe 7 g, Hefeextrakt 3 g, Lactose 10 g, NaCl 5 g, Gallensalze 1,5 g, Neutralrot 0,03 g, Kristallviolett 0,002 g, Agar 12–18 g, Wasser 1000 ml; pH nach dem Kochen 7,4 ± 0,2 bei 25 °C; das Nährmedium wird zum Sieden gebracht, 2 min gekocht, sofort im Bad auf 44–47 °C abgekühlt, nicht autoklaviert und nicht wieder erwärmt, binnen 4 h verbraucht, und die Sterilität wird mit einer Kontrollplatte überprüft. Das Bestätigungsnährmedium — Bouillon mit Lactose, Galle und Brillantgrün (Caseinhydrolysat 10 g, Lactose 10 g, getrocknete Rindergalle 20 g, Brillantgrün 0,0133 g/l; pH 7,2 ± 0,2; zu je 10 ml in Röhrchen mit Durham-Röhrchen; 121 °C 15 min). Die Zeit vom Ende der Herstellung der Erstverdünnung bis zum Übergießen der Platten darf 15 min nicht überschreiten.

Anwendungen

• Kontrolle der Hygiene der Lebensmittelherstellung (Fleisch, Milcherzeugnisse, Feinkosterzeugnisse) bei einer erwarteten Zahl der Coliformen > 100/g
• Milch und Milcherzeugnisse — Bebrütung bei 30 °C
• Umgebungsproben aus den Bereichen der Herstellung und des Verkehrs mit Lebensmitteln
• Futtermittel und pflanzliche Rohstoffe
• Untersuchungen im Rahmen von Werknormen und Abnehmerspezifikationen (zusätzliches Kriterium außerhalb der Verordnung 2073/2005)

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-ISO 4832:2007 (ISO 4832:2006)

Titel (PL)

Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby bakterii z grupy coli — Metoda płytkowa

Title (EN)

Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of coliforms — Colony-count technique

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Probe und Verdünnungen

   Bereite die Probe, die Erstverdünnung und die Zehnerverdünnungen nach ISO 6887 (zutreffender Teil), ISO 8261 oder der Norm für das Erzeugnis vor.

2. Beimpfen

   Überführe mit einer sterilen Pipette 1 ml des flüssigen Erzeugnisses oder der gewählten Verdünnung in die Mitte jeder der beiden Platten (je Verdünnung eine eigene Pipette).

3. Übergießen mit dem Nährmedium

   Gieße in jede Platte etwa 15 ml VRBL von 44–47 °C (spätestens 15 min nach der Herstellung der Erstverdünnung), mische vorsichtig und lass auf einer kalten waagerechten Fläche erstarren; bereite eine Kontrollplatte mit 15 ml Nährmedium zur Prüfung der Sterilität vor.

4. Deckschicht

   Bringe nach dem vollständigen Erstarren etwa 4 ml VRBL (44–47 °C) auf die Oberfläche und lass sie erstarren.

5. Bebrütung

   Bebrüte die umgedrehten Platten 24 h ± 2 h bei 30 °C oder 37 °C (wie vereinbart).

6. Zählen

   Wähle die Platten mit 10–150 Kolonien; zähle die purpurroten Kolonien mit einem Durchmesser ≥ 0,5 mm (mitunter mit einem rötlichen Hof ausgefällter Galle) — sie sind typisch und bedürfen keiner Bestätigung. Zähle und bestätige die untypischen Kolonien (z. B. kleinere) sowie alle Kolonien aus Milcherzeugnissen, die andere Zucker als Lactose enthalten.

7. Bestätigung und Ergebnis

   Impfe je fünf Kolonien jedes untypischen Typs in die Bouillon mit Lactose, Galle und Brillantgrün und bebrüte 24 h ± 2 h bei derselben Temperatur; erkenne die Kolonien, die Gas im Durham-Röhrchen bilden, als coliform an und berücksichtige sie in der Berechnung; das Ergebnis nach ISO 7218; gib im Prüfbericht die Bebrütungstemperatur, das Verfahren der Probenahme und die Abweichungen an.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Kochen des VRBL-Nährmediums und Arbeit mit Agar von 44–47 °C — Schutz vor Verbrennungen; das Nährmedium nicht wieder erwärmen
• Die Kulturen können pathogene Enterobacteriaceae enthalten — gute mikrobiologische Praxis, Autoklavieren der Abfälle
• Kristallviolett und Brillantgrün — Hautkontakt und Staubentwicklung beim Einwiegen vermeiden

Häufige Fragen