🧫 Bacillus cereus in Lebensmitteln
Bestimmung von vermutlichem Bacillus cereus in Lebensmitteln mittels Oberflächenaussaat auf MYP-Agar (Mannitol-Egg Yolk-Polymyxin) bei 30°C mit Hämolyse-Bestätigung.
Übersicht
Bacillus cereus ist ein grampositives, aerobes, sporenbildendes Bakterium, das weit in der Umwelt verbreitet ist — es kommt in Boden, Staub, Pflanzen und vielen Lebensmittelrohstoffen vor. B. cereus verursacht zwei Arten von Lebensmittelvergiftungen: emetisches Syndrom (emetischer Typ, verursacht durch Cereulid-Toxin — Inkubation 1–5 h) und Durchfall-Syndrom (diarrhoischer Typ, verursacht durch Hbl-, Nhe-, CytK-Enterotoxine — Inkubation 8–16 h).
Die Norm PN-EN ISO 7932 legt ein horizontales Verfahren zur Bestimmung von vermutlichem B. cereus durch Koloniezählung auf MYP-Medium (Mannitol-Egg Yolk-Polymyxin Agar, Mossel-Medium) fest. Das Medium basiert auf drei Differenzierungsmechanismen: Unfähigkeit von B. cereus zur Mannitol-Fermentation (rosa Kolonien auf Phenolrot-Hintergrund), Lecithinase-Produktion (weiße Präzipitationszone um Kolonien aus Eigelb) und Polymyxin-B-Resistenz (Hemmung gramnegativer Bakterien).
Der Begriff "vermutlich" (presumptive) ergibt sich daraus, dass die Methode keine vollständige Differenzierung von B. cereus von eng verwandten Arten der B. cereus sensu lato-Gruppe (B. thuringiensis, B. mycoides, B. weihenstephanensis, B. anthracis) erlaubt. Die Bestätigung basiert auf Hämolyse-Test auf Schafblut-Agar.
Die Methode ist erforderlich in der Qualitätskontrolle von Reis, Nudeln, Soßen, Gewürzen, Milchprodukten, Säuglingsnahrung und verzehrfertigen Gerichten. B. cereus stellt eine besondere Gefahr in Catering und Gastronomie dar, wo Fehler beim Kühlen und Aufwärmen die bakterielle Vermehrung begünstigen.
Prinzip der Methode
Die Methode verwendet MYP-Medium, in dem Mannitol und Phenolrot ein Indikatorsystem bilden (B. cereus fermentiert Mannitol nicht — rosa Kolonien), Eigelb-Emulsion Lecithinase nachweist (weiße Präzipitationszone), und Polymyxin B das Wachstum gramnegativer Bakterien hemmt. Wir säen die Probe oberflächlich aus und inkubieren bei 30 ± 1°C für 24 h. Typische B. cereus-Kolonien sind groß (ca. 5 mm), rosa, rau, trocken, umgeben von weißer Präzipitationszone. Die Bestätigung erfolgt durch Hämolyse-Test — B. cereus zeigt starke β-Hämolyse auf Schafblut-Agar.
Anwendungen
- Qualitätskontrolle von Reis, Nudeln und Getreideprodukten
- Untersuchung von Soßen, Gewürzen und Gewürzmischungen
- Milchproduktkontrolle (Milchpulver, Käse)
- Untersuchung von Säuglingsnahrung und Milchersatzpräparaten
- Überwachung von verzehrfertigen und Catering-Gerichten
- Verifizierung von HACCP-Systemen — Lagertemperaturkontrolle
- Analyse pflanzlicher Rohstoffe (Mehl, Stärke, Kräutertees)
Schlüsselparameter
| Parameter | Wert |
|---|---|
| Inkubationstemperatur | 30 ± 1°C |
| Inkubationszeit | 18–24 h (MYP), 24 ± 2 h (Hämolyse) |
| Medium | MYP Agar (Mannitol-Egg Yolk-Polymyxin, Mossel-Medium) |
| Kolonietyp | Groß (~5 mm), rosa, trocken, mit weißem Präzipitat |
| Plattierungsmethode | Oberflächenaussaat (Spread Plate), 0,1 mL pro Platte |
| Bestätigung | Hämolyse-Test auf Schafblut-Agar (β-Hämolyse) |
Norm
- Normnummer
- PN-EN ISO 7932:2005
- Titel (PL)
- Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby domniemanego Bacillus cereus — Metoda liczenia kolonii w temperaturze 30°C
- Title (EN)
- Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of presumptive Bacillus cereus — Colony-count technique at 30 degrees C
Schritt-für-Schritt-Verfahren
1. Probenvorbereitung
Wiegen Sie 10 g Probe in einen Stomacher-Beutel, fügen Sie 90 mL BPW hinzu, homogenisieren Sie für 60–120 s. Bereiten Sie Dezimalverdünnungen vor.
2. MYP-Medium-Vorbereitung
Lösen Sie 46 g MYP Agar Base in 900 mL destilliertem Wasser. Sterilisieren Sie im Autoklav (121°C/15 min). Kühlen Sie auf 45–50°C ab, fügen Sie aseptisch 100 mL Eigelb-Emulsion und Polymyxin-B-Lösung hinzu. Gießen Sie 15–20 mL pro Platte, lassen Sie erstarren und trocknen.
3. Oberflächenaussaat
Bringen Sie 0,1 mL jeder Verdünnung auf die MYP-Plattenoberfläche auf. Verteilen Sie mit Drigalski-Spatel. Lassen Sie bis zur Absorption des Inokulums (ca. 15 min).
4. Inkubation
Drehen Sie die Platten um und inkubieren Sie bei 30 ± 1°C für 18–24 h unter aeroben Bedingungen.
5. Kolonieablesung auf MYP
Zählen Sie typische B. cereus-Kolonien: groß (~5 mm), rosa (mannitol-negativ), umgeben von weißer Präzipitationszone (Lecithinase+). Zählen Sie auch atypische Kolonien (rosa ohne Präzipitat).
6. Hämolyse-Test (Bestätigung)
Wählen Sie min. 5 typische und 5 atypische Kolonien. Säen Sie auf Schafblut-Agar aus, trennen Sie Kolonien zur Ermöglichung der Hämolyse-Beurteilung. Inkubieren Sie 24 ± 2 h bei 30°C.
7. Hämolyse-Beurteilung
B. cereus zeigt starke β-Hämolyse (Aufhellung um Kolonie). Berechnen Sie den Prozentsatz bestätigter Isolate.
8. Berechnungen und Berichterstattung
Berechnen Sie die Anzahl von vermutlichem B. cereus unter Berücksichtigung des Prozentsatzes bestätigter Kolonien. Ergebnis in KBE/g ausdrücken. Ergebnis als "vermutlicher Bacillus cereus" berichten.
Erforderliche Geräte und Apparatur
| Gerät | Beispiel | Richtpreis |
|---|---|---|
| Laborinkubator 30°C | Binder BD 56, Memmert INB 200, POL-EKO CLN 53 | 5.000–18.000 PLN |
| Laminar-Flow-Werkbank Klasse II | Thermo Scientific MSC-Advantage, ESCO Airstream AC2 | 25.000–60.000 PLN |
| Stomacher / Homogenisator | Seward Stomacher 400 Circulator, BagMixer 400 | 12.000–25.000 PLN |
| Wasserbad 44–47°C | Memmert WNB 14, Julabo TW 12 | 3.000–10.000 PLN |
| Laborautoklav | Tuttnauer 2540M, Systec VX-65 | 15.000–45.000 PLN |
Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien
| Reagenz | CAS | Details |
|---|---|---|
| MYP Agar Base (Mossel-Medium) | 69-65-8 | Pepton, Fleischextrakt, Mannitol, Natriumchlorid, Phenolrot, Agar; 500 g Packung |
| Eigelb-Emulsion (Egg Yolk Emulsion 50%) | — | Supplement für MYP — weist Lecithinase-Aktivität nach, 100 mL zu 900 mL Medium |
| Polymyxin B (selektives Supplement) | 1405-20-5 | Antibiotikum zur Hemmung gramnegativer Bakterien; Arbeitskonzentration 100 IU/mL; 10 Fläschchen Packung |
| Schafblut-Agar (Columbia Blood Agar) | — | Für Hämolyse-Test — B. cereus-Bestätigung (β-Hämolyse); fertige Platten |
| D-Mannitol | 69-65-8 | Zuckeralkohol — Indikatorsystem in MYP (B. cereus mannitol-negativ) |
| Phenolrot (Phenol Red) | 143-74-8 | pH-Indikator im MYP-Medium — Farbwechsel bei Mannitol-Fermentation |
| Gepuffertes Peptonwasser (BPW) | — | Für Probenverdünnungen, 500 g Packung |
Arbeitsschutz und Sicherheit
- B. cereus — BSL-2-Erreger mit Toxinproduktionsfähigkeit, PSA verwenden
- B. cereus-Sporen überleben Autoklavieren — besondere Vorsicht walten lassen
- Polymyxin B — Antibiotikum, Hautkontakt und Einatmen vermeiden
- Arbeit in Laminar-Flow-Werkbank Klasse II obligatorisch
- Gebrauchte Materialien autoklavieren (121°C/30 min) vor Entsorgung
- Oberflächendesinfektion mit sporozidem Mittel (z.B. 3% Wasserstoffperoxid)