🍎 Nitrat und Nitrit in Fleischerzeugnissen — Reduktion mit Nitratreduktase, Griess-Reaktion, Spektrometrie bei 540 nm

Lebensmittelchemie PN-EN 12014-3

Übersicht

Die Norm legt ein spektrometrisches Verfahren zur Bestimmung des Nitrat- und Nitritgehalts in Fleischerzeugnissen fest, validiert für verschiedene Erzeugnisse mit einem Gehalt von 9–22 mg/kg Nitrit (als Natriumnitrit) und 23–48 mg/kg Nitrat (als Natriumnitrat); der Erfahrung nach eignet sich das Verfahren auch für einen Gesamtgehalt an Nitrit und Nitrat von 5 bis 125 mg/kg, berechnet als Natriumnitrit. EN 12014-3:2005 hat ENV 12014-3:1998 ersetzt und gehört zur Reihe „Oznaczanie zawartości azotanów i/lub azotynów" [Bestimmung des Nitrat- und/oder Nitritgehalts] (Teil 2: HPLC/IC für Gemüse, Teil 4: IC für Fleischerzeugnisse, Teil 5: enzymatisches Verfahren für Säuglingsnahrung, Teil 7: Fließverfahren nach Cadmiumreduktion). Die Beschreibung stützt sich auf die Vorschau der EN 12014-3:2005 (bis Abschnitt 6.2.1); PN-EN 12014-3:2006 mit der Berichtigung Ap1:2008 steht im Verzeichnis der Prüfverfahren des Branchenheftes des QAFP-Systems für Konserven.

Natrium- und Kaliumnitrat (E251, E252) sowie Kalium- und Natriumnitrit (E249, E250) werden in der Fleischverarbeitung als Zusatzstoffe verwendet: Nitrite geben den Erzeugnissen die rosa Pökelfarbe (Nitrosylmyoglobin), das Aroma und den Pökelgeschmack, wirken antioxidativ und hemmen die Entwicklung von Clostridium botulinum und C. perfringens, und die Nitrate sind ihr Vorrat, aus dem beim Pökeln Nitrite entstehen; Natriumnitrit ist jedoch potenziell krebserzeugend (Nitrosamine) und ruft Methämoglobinämie hervor. Nach den in Bromatologia i Chemia Toksykologiczna (2009) angeführten Vorschriften wird Nitrit ausschließlich in einer Mischung mit NaCl verwendet, die 0,5–0,6 % NaNO2 enthält, in Salami soll der Nitritgehalt unter 60 mg/kg liegen und die Summe aus Nitrit und Nitrat darf 600 mg/kg nicht überschreiten; in den übrigen Wurstwaren, Feinkosterzeugnissen und pasteurisierten Konserven darf der Gesamtgehalt 125 mg/kg nicht überschreiten.

Das Prinzip der Nitritbestimmung beruht auf der Griess-Reaktion: das Nitrit bildet mit Sulfanilamid ein Diazoniumsalz, das sich mit N-(1-Naphthyl)ethylendiamin zu einem roten Azofarbstoff kuppelt; das Nitrat im Extrakt wird mit Nitratreduktase (anstelle einer Cadmiumsäule) zu Nitrit reduziert und aus der Differenz zweier Messungen berechnet.

Prinzip der Methode

Von der homogenisierten Probe (Temperatur unter 25 °C; ein Fleischwolf mit Löchern ≤ 4,5 mm, zweimaliges Durchlassen) werden 10 g (auf 10 mg) mit etwa 50 ml Wasser 30–60 s homogenisiert, mit 50 ml heißem Wasser nachgespült, der pH-Wert wird mit einer NaOH-Lösung von etwa 1 mol/l auf 8,0–8,5 eingestellt und es wird 15 min im siedenden Bad unter Schütteln erwärmt. Nach dem Abkühlen wird der Extrakt in einen 200-ml-Kolben überführt, es werden je 4 ml der Carrez-Lösungen Nr. 1 (150 g Kaliumhexacyanoferrat(II) in 1 l) und Nr. 2 (230 g Zinkacetat in 1 l) zugegeben, mit Wasser aufgefüllt und durch ein nitrat- und nitritfreies Faltenfilter filtriert, wobei die ersten 20 ml verworfen werden. Nitrit: 2,0 ml der Lösung werden mit 1,0 ml Wasser und 3,0 ml der Mischung der Farbreagenzien gemischt (gleiche Volumina einer Lösung von 8 g Sulfanilamid in 1 l mit 330 ml HCl und einer Lösung von 0,330 g N-(1-Naphthyl)ethylendiamin-dihydrochlorid in 250 ml), im Dunkeln aufbewahrt, und nach 30 min wird die Extinktion bei 540 nm gegen Wasser gemessen. Nitrat: eine Portion des Extrakts wird mit Imidazolpuffer pH 7,8, NADPH mit FAD und Nitratreduktase (Aspergillus sp., EC 1.6.6.2) inkubiert — das entstandene Nitrit reagiert zusammen mit dem ursprünglichen mit den Farbreagenzien; der Nitratgehalt wird aus der Differenz berechnet. Die Kalibrierkurven werden aus Lösungen von Natriumnitrit (0,13–0,53 mg NO2− in 200 ml) und Kaliumnitrat (0,14–0,55 mg, berechnet als Nitrit) erstellt, die mit der Carrez-Klärung wie die Proben vorbereitet werden.

Anwendungen

• Kontrolle des Nitrit- und Nitratgehalts (E249–E252) in Wurstwaren, Konserven und Feinkosterzeugnissen
• Amtliche Überwachung der Höchstgehalte an Zusatzstoffen in Fleischerzeugnissen
• Untersuchungen des Pökelns und der Umwandlungen des Nitrats während der Reifung von Wurstwaren
• Prüfverfahren des Qualitätssystems QAFP für Fleischkonserven
• Ein cadmiumfreies Verfahren — eine Alternative zur Cadmiumreduktion in Laboratorien, die giftige Abfälle verringern

Schlüsselparameter

Norm

Normnummer

PN-EN 12014-3:2006

Titel (PL)

Artykuły żywnościowe — Oznaczanie zawartości azotanów i/lub azotynów — Część 3: Spektrometryczne oznaczanie zawartości azotanów i azotynów w produktach mięsnych po enzymatycznej redukcji azotanów do azotynów

Title (EN)

Foodstuffs — Determination of nitrate and/or nitrite content — Part 3: Spectrometric determination of nitrate and nitrite content of meat products after enzymatic reduction of nitrate to nitrite

Schritt-für-Schritt-Verfahren

1. Homogenisierung

   Die Laborprobe so homogenisieren, dass die Temperatur 25 °C nicht überschreitet; beim Fleischwolf mindestens zweimal durchlassen.

2. Extraktion

   10 g (auf 10 mg) in einen weithalsigen Erlenmeyerkolben einwägen, etwa 50 ml Wasser zugeben, 30–60 s homogenisieren, den Schaft des Homogenisators mit 50 ml heißem Wasser abspülen. Den pH-Wert mit NaOH-Lösung auf 8,0–8,5 einstellen (pH-Meter); bei rohen Erzeugnissen 8,5 nicht überschreiten, bei gebrühten und gekochten ist bis etwa 9,5 zulässig.

   ⏱ Zeit: 30–60 s

3. Erwärmen

   Den Kolben 15 min im siedenden Wasserbad erwärmen und dabei mehrmals schütteln; auf Raumtemperatur abkühlen.

   ⏱ Zeit: 15 min • 🌡 Temperatur: 100 °C

4. Klärung

   Quantitativ in einen 200-ml-Messkolben überführen, je 4 ml der Carrez-Lösung Nr. 1 und Nr. 2 zugeben und nach jeder Zugabe schütteln; mit Wasser auffüllen, mischen, durch ein Faltenfilter filtrieren und die ersten 20 ml des Filtrats verwerfen (die Probenlösung).

5. Standardlösungen

   In eine Reihe von 200-ml-Kolben 10, 20, 30 und 40 ml der verdünnten Natriumnitritlösung abmessen (0,13; 0,27; 0,40; 0,53 mg NO2−) sowie — gesondert — des Kaliumnitrats (0,14; 0,27; 0,41; 0,55 mg als Nitrit), den pH-Wert auf 8,0–8,5 einstellen, je 4 ml Carrez Nr. 1 und Nr. 2 zugeben, auffüllen, filtrieren und die ersten 20 ml verwerfen.

6. Bestimmung des Nitrits

   Im Reagenzglas 2,0 ml der Lösung (der Probe oder des Standards) mit 1,0 ml Wasser und 3,0 ml der Mischung der Farbreagenzien mischen, schütteln und im Dunkeln bei Raumtemperatur aufbewahren; nach 30 min die Extinktion bei 540 nm gegen Wasser messen.

   ⏱ Zeit: 30 min

7. Bestimmung des Nitrats

   Eine Portion der Probenlösung (und der Nitratstandards) mit dem Imidazolpuffer, der NADPH/FAD-Lösung und der Lösung der Nitratreduktase nach Abschnitt 6 der Norm inkubieren und anschließend die Farbreaktion wie beim Nitrit ausführen.

8. Kalibrierkurven und Berechnungen

   Die Extinktionen der Standards gegen die Masse des Nitrits (mg in 200 ml) auftragen. Den Nitritgehalt der Probe und den Gesamtgehalt nach der Reduktion ablesen; das Nitrat aus der Differenz berechnen und die Ergebnisse in mg NaNO2 und NaNO3 je kg ausdrücken.

9. Prüfbericht

   Die Kennzeichnung der Probe, die Berufung auf EN 12014-3, die Ergebnisse für Nitrit und Nitrat, das Datum und die Abweichungen von der Norm angeben; die Angaben zur Präzision stehen im Anhang A.

Erforderliche Geräte und Apparatur

Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien

Arbeitsschutz und Sicherheit

• Salzsäure 37 % im Farbreagenz — Abzug, Schutzbrille, Handschuhe
• N-(1-Naphthyl)ethylendiamin-dihydrochlorid und Natriumnitrit — Staubentwicklung und Hautkontakt vermeiden; Natriumnitrit ist giftig beim Verschlucken
• Siedendes Wasserbad und das Homogenisieren mit heißem Extrakt — Schutz vor Verbrühungen
• Die Carrez-Reagenzien enthalten Hexacyanoferrat — die Abfälle nicht ansäuern (Gefahr der Freisetzung von Cyanwasserstoff)

Häufige Fragen