🥜 Lebensmittelallergene (ELISA)
Quantitative Bestimmung von Lebensmittelallergenen (Gluten, Milch, Ei, Erdnuss, Soja u.a.) in Lebensmitteln mittels Enzymimmunoassay ELISA unter Verwendung zertifizierter Testkits.
Übersicht
Die Bestimmung von Lebensmittelallergenen ist ein Schlüsselelement der Lebensmittelsicherheit — die Verordnung (EU) 1169/2011 verlangt die Deklaration der 14 Hauptallergene auf Lebensmitteletiketten. Die ELISA-Methode (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) ist die am weitesten verbreitete Labortechnik zur quantitativen Bestimmung allergener Proteine in Lebensmitteln und auf Kontaktflächen.
Das Prinzip der Methode beruht auf der spezifischen Antigen-Antikörper-Bindung. Es gibt zwei Hauptformate: Sandwich-ELISA — weist intakte Proteine und große Fragmente mit zwei Epitopen nach, und kompetitiver ELISA — weist auch kleine Proteinfragmente nach, was für stark thermisch verarbeitete Lebensmittel entscheidend ist.
Die am häufigsten verwendeten kommerziellen Kits sind: RIDASCREEN (R-Biopharm), Veratox und Reveal (Neogen), AgraQuant (Romer Labs) sowie ELISA Systems. Diese Kits besitzen eine AOAC-OMA-Validierung (Official Methods of Analysis) und werden vom Codex Alimentarius empfohlen. Typisch bestimmte Allergene sind: Gluten (Prolamine aus Weizen, Roggen, Gerste), Milchproteine (Casein, β-Lactoglobulin), Eiproteine (Ovalbumin, Ovomukoid), Erdnussproteine (Ara h1, Ara h2), Sojaproteine, Nüsse, Sesam und Senf.
Die Nachweisgrenzen der ELISA liegen typischerweise bei 1–5 mg/kg (ppm) Allergen im Produkt, was die Bewertung der Einhaltung von Sicherheitsschwellenwerten ermöglicht. Laboratorien, die diese Untersuchungen durchführen, nehmen an PT-Programmen (FAPAS, LGC) teil und sind nach ISO 17025 akkreditiert.
Prinzip der Methode
Bei der Sandwich-ELISA: Die Vertiefungen der Mikrotiterplatte sind mit allergenspezifischen Antikörpern beschichtet. Der Lebensmittelextrakt wird in der Vertiefung inkubiert — das Allergen bindet an die Antikörper. Nach dem Waschen wird ein zweiter enzymmarkierter Antikörper (HRP oder AP) hinzugefügt, der an ein anderes Epitop des Allergens bindet (bildet ein „Sandwich"). Nach erneutem Waschen wird das Enzymsubstrat hinzugefügt — es entsteht ein Farbprodukt, dessen Intensität (Absorbanz) proportional zur Allergenkonzentration ist. Ablesung am Mikrotiterplatten-Reader bei 450 nm.
Anwendungen
- Qualitätskontrolle der glutenfreien Produktion (Grenzwert < 20 mg/kg nach Codex)
- Verifizierung der Reinigung von Produktionslinien (Abstriche) — Vermeidung von Kreuzkontamination
- Untersuchung von Rohstoffen und Halbfertigprodukten auf nicht deklarierte Allergene
- Kontrolle importierter Lebensmittel durch die Lebensmittelüberwachung
- Lebensmitteluntersuchungen im Zusammenhang mit Produktrückrufen (Recall)
- Validierung von Reinigungsverfahren in Lebensmittelbetrieben
- Analyse von Säuglings- und Kleinkindnahrung (verschärftes Allergenregime)
Schlüsselparameter
| Parameter | Wert |
|---|---|
| Nachweisgrenze (LOD) | 1–5 mg/kg (ppm) Allergen |
| Bestimmungsbereich | 5–200 mg/kg (typischer Kalibrierbereich) |
| Analysenzeit | 30–90 min (je nach Kit — FAST vs. Standard) |
| Format | Mikrotiterplatte 96-Vertiefungen (12 Streifen × 8 Vertiefungen) |
| Ablesewellenlänge | 450 nm (mit Referenz 620–650 nm) |
| Glutengrenzwert nach Codex | < 20 mg/kg Gliadin (= < 20 ppm Gluten) |
Norm
- Normnummer
- AOAC 2012.01 / AOAC 2014.03 / AOAC 991.19 (seria metod ELISA)
- Titel (PL)
- Oznaczanie alergenów pokarmowych metodą immunoenzymatyczną ELISA
- Title (EN)
- Determination of food allergens by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Schritt-für-Schritt-Verfahren
1. Probenvorbereitung
Lebensmittelprobe zu einer homogenen Masse homogenisieren. 1 g in ein Extraktionsröhrchen einwiegen.
2. Extraktion
10 mL Kit-Extraktionspuffer hinzufügen. 10 min bei Raumtemperatur schütteln/mischen (oder 60°C für Gluten mit Mendez-Cocktail).
3. Zentrifugation und Verdünnung
10 min bei 2500 × g zentrifugieren. Überstand entnehmen. Gemäß Kit-Anleitung verdünnen (typisch 1:10 oder 1:100).
4. Auftragen auf die Mikrotiterplatte
Je 100 µL Kalibrierstandards (5 Konzentrationen + Nullwert), Proben und Kontrollen in die entsprechenden Vertiefungen pipettieren. Jeweils als Doppelbestimmung.
5. Inkubation I
Mikrotiterplatte 30 min bei Raumtemperatur inkubieren (oder 10 min für FAST-Kits). Sanftes Schütteln.
6. Waschen
3× mit je 300 µL Waschpuffer waschen. Restflüssigkeit durch Umdrehen und Abtupfen auf Zellstoff entfernen.
7. Inkubation mit Konjugat
100 µL Enzym-Antikörper-Lösung (Konjugat) hinzufügen. 30 min bei RT inkubieren.
8. Waschen II
3× waschen wie in Schritt 6.
9. Farbentwicklung
100 µL Enzymsubstrat (TMB) hinzufügen. 15 min im Dunkeln inkubieren. 100 µL Stopplösung hinzufügen.
10. Absorbanz-Ablesung
Absorbanz am Mikrotiterplatten-Reader bei 450 nm messen (Referenz 620 nm). Innerhalb von 30 min nach dem Stoppen ablesen.
11. Ergebnisberechnung
Kalibrierkurve erstellen (Absorbanz vs. Konzentration). Allergenkonzentration in den Proben ablesen. In mg/kg im Produkt umrechnen.
Erforderliche Geräte und Apparatur
| Gerät | Beispiel | Richtpreis |
|---|---|---|
| Mikrotiterplatten-Reader | Tecan Sunrise, BioTek ELx800, Thermo Multiskan FC | 15 000–50 000 PLN |
| Inkubator (37°C oder RT) | Inkubator mit Mikrotiterplatten-Schüttler, Heidolph Titramax 1000 | 3 000–8 000 PLN |
| Mikrotiterplatten-Washer | BioTek ELx50, Tecan HydroFlex, Thermo Wellwash | 15 000–40 000 PLN |
| Homogenisator | IKA Ultra-Turrax T25, Stomacher 400 | 5 000–15 000 PLN |
| Mehrkanalpipetten | Eppendorf Research Plus 8-Kanal (10–100 µL, 100–1200 µL) | 2 000–5 000 PLN |
| Analysenwaage | Mettler Toledo MS105DU, RADWAG AS 220.R2 | 8 000–20 000 PLN |
Reagenzien, Nährmedien und Verbrauchsmaterialien
| Reagenz | CAS | Details |
|---|---|---|
| ELISA-Kit Gluten (RIDASCREEN Gliadin) | — | R-Biopharm R7001 — Sandwich-ELISA zur Gliadinbestimmung, AOAC-OMA-Zertifikat, 96 Tests, ~2 500 PLN |
| ELISA-Kit Milch (RIDASCREEN FAST Milk) | — | R-Biopharm R4652 — FAST 30 min, LOD 0,7 mg/kg, 48 Tests |
| ELISA-Kit Ei (Neogen Veratox Egg) | — | Neogen 8470 — Sandwich-ELISA, LOD 2,5 mg/kg, 48 Tests |
| ELISA-Kit Erdnuss (RIDASCREEN FAST Peanut) | — | R-Biopharm R6802 — LOD 0,1 mg/kg, AOAC-OMA-Validierung |
| ELISA-Kit Soja (AgraQuant Soy) | — | Romer Labs — kompetitive ELISA für Sojaproteine, 96 Tests |
| Extraktionspuffer | — | Im Kit enthalten oder gemäß Herstelleranleitung (z.B. Mendez-Cocktail für Gluten) |
Arbeitsschutz und Sicherheit
- Stopplösung (H₂SO₄) — ätzend, Schutzbrille und Handschuhe verwenden
- Extraktionspuffer — kann Mercaptoethanol enthalten (toxisch) — unter dem Abzug arbeiten
- TMB-Substrat — Verdacht auf mutagene Wirkung, Handschuhe verwenden
- Biologisches Material (Lebensmittelproben mit Allergenen) — Reaktionsrisiko bei sensibilisierten Personen
- Mikrotiterplatten-Abfälle — Entsorgung als Laborabfall