🧪 WWA (PAH) w wodzie
Oznaczanie 15 wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w wodzie metodą HPLC z detekcją fluorescencyjną po ekstrakcji ciecz-ciecz. Czułość > 0,005 µg/L.
Przegląd
Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA/PAH) to grupa ponad 100 związków organicznych składających się z dwóch lub więcej skondensowanych pierścieni aromatycznych. Wiele z nich jest rakotwórczych — benzo(a)piren jest kancerogen grupy 1 IARC, a kilkanaście innych jest klasyfikowanych jako prawdopodobne lub możliwe kancerogeny.
PN-EN ISO 17993:2005 określa metodę oznaczania 15 wybranych WWA w wodzie pitnej, podziemnej i powierzchniowej: naftalen, acenaftylen (tylko UV), acenaften, fluoren, fenantren, antracen, fluoranten, piren, benzo(a)antracen, chryzen, benzo(b)fluoranten, benzo(k)fluoranten, benzo(a)piren, dibenzo(a,h)antracen, benzo(ghi)perylen, indeno(1,2,3-cd)piren.
Dopuszczalne stężenia w wodzie pitnej (Dz.U. 2017 poz. 2294): benzo(a)piren ≤ 0,01 µg/L, suma WWA (4 związki) ≤ 0,1 µg/L. Normy te są bardzo restrykcyjne i wymagają technik o ekstremalnej czułości, stąd konieczność zastosowania detekcji fluorescencyjnej.
Zasada metody
Metoda składa się z trzech etapów: (1) ekstrakcja ciecz-ciecz, (2) rozdzielenie chromatograficzne HPLC, (3) detekcja fluorescencyjna.
1. Ekstrakcja: WWA z próbki wodnej są ekstrahowane do cykloheksanu lub dichlorometanu w lejku rozdzielczym. Ekstrakt jest odparowywany i rekonstytucja w acetonitrylu (rozpuszczalnik HPLC).
2. Chromatografia HPLC: Rozdzielenie 15 WWA na kolumnie C18 (faza odwrócona) z gradientowym elucją woda/acetonitryl. Czas analizy 30–60 min. Każdy WWA eluuje w innym czasie retencji.
3. Detekcja fluorescencyjna (FLD): WWA wykazują silną fluorescencję natywną — absorbują promieniowanie UV i emitują w zakresie widzialnym. Detektor fluorescencyjny mierzy emisję przy programowanych długościach fali (różne pary Ex/Em dla różnych grup WWA), co zapewnia ekstremalną czułość (LOD ~ 0,001 µg/L) i selektywność.
Naftalen i acenaftylen — słabo fluoryzujące — oznaczane są alternatywnie detektorem UV-DAD.
Zastosowania
- Kontrola jakości wody pitnej (benzo(a)piren ≤ 0,01 µg/L, suma WWA ≤ 0,1 µg/L)
- Monitoring wód powierzchniowych — substancje priorytetowe (Dyrektywa 2013/39/UE)
- Analiza wód podziemnych (zanieczyszczenie ze starych gazowni, koksowni)
- Monitoring wód opadowych (spaliny, pył PM2.5)
- Kontrola ścieków przemysłowych (rafinerie, koksownie)
- Badania środowiskowe terenów poprzemysłowych (brownfields)
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Liczba oznaczanych WWA | 15 (lista EPA/ISO) |
| Granica oznaczalności (FLD) | 0,005 µg/L (wody pitne i podziemne) |
| Granica oznaczalności (FLD, wody pow.) | 0,01 µg/L |
| Metoda detekcji | Fluorescencja (FLD) + UV-DAD (naftalen, acenaftylen) |
| Kolumna HPLC | C18 faza odwrócona, 250 × 4,6 mm, 5 µm |
| Czas analizy | 30–60 min/próbka (gradient) |
Norma
- Numer normy
- PN-EN ISO 17993:2005
- Tytuł (PL)
- Jakość wody — Oznaczanie 15 wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA) w wodzie metodą HPLC z detekcją fluorescencyjną po ekstrakcji ciecz-ciecz
- Title (EN)
- Water quality — Determination of 15 polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) in water by HPLC with fluorescence detection after liquid-liquid extraction
Procedura krok po kroku
1. Pobranie próbki
Pobierać do butelek ze szkła ciemnego (ochrona przed fotodegradacją WWA). Napełnić bez zostawiania przestrzeni nad próbką. Transport w ciemności, 4°C. Analiza w ciągu 7 dni.
2. Ekstrakcja ciecz-ciecz
Przenieść 1 L próbki do lejka rozdzielczego 2 L. Dodać 50 mL cykloheksanu. Wstrząsać 10 min. Rozdzielić fazy. Powtórzyć 2× po 25 mL. Połączyć ekstrakty.
3. Suszenie i zatężanie
Przesączyć ekstrakt przez Na₂SO₄ bezwodny. Odparować na ewaporatorze rotacyjnym do ~1 mL (temp. łaźni < 40°C, próżnia). Zamienić rozpuszczalnik na ACN.
4. Rekonstytucja
Rozpuścić pozostałość w 1 mL acetonitrylu (ACN). Przenieść do vialki HPLC z wkładką. Wirować 5 min/10000 obr. (opcjonalnie filtr 0,22 µm PTFE).
5. Analiza HPLC
Nastrzyk 10–50 µL na kolumnę C18 PAH. Gradient ACN/H₂O: 50% → 100% ACN w 30–50 min. Detekcja FLD z przełączaniem Ex/Em. UV-DAD dla naftalenu/acenaftylenu.
6. Identyfikacja i obliczenia
Identyfikacja na podstawie czasu retencji (±2%). Kwantyfikacja z krzywej kalibracyjnej (5–7 punktów). Uwzględnić odzysk ekstrakcji (dodanie surogatów).
7. Kontrola jakości
Próbka ślepa (woda HPLC przez ekstrakcję). Próbka fortyfikowana (spike). CRM (woda certyfikowana na PAH). Odzysk 60–120%.
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| System HPLC z detektorem FLD | Agilent 1260/1290 Infinity + FLD, Waters Alliance + FLD 2475, Shimadzu Nexera + RF-20A | 200 000–500 000 PLN |
| Detektor UV-DAD (dodatkowy) | Do oznaczania naftalenu i acenaftylenu | 50 000–120 000 PLN |
| Kolumna HPLC C18 do PAH | Waters PAH C18, Agilent ZORBAX Eclipse PAH, Supelcosil LC-PAH | 1 500–3 500 PLN |
| System ekstrakcji ciecz-ciecz | Lejki rozdzielcze 1–2 L, ewaporator rotacyjny (Buchi R-300) | 15 000–40 000 PLN (ewaporator) |
| Autosampler | Agilent G7167B, Waters 2707 | w zestawie z HPLC |
| Odgazowywacz i pompa gradientowa | Czteropompowy system gradientowy — standard w HPLC | w zestawie z HPLC |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| Acetonitryl (ACN) HPLC grade | 75-05-8 | Czystość HPLC gradient grade (Merck LiChrosolv), faza ruchoma |
| Woda HPLC grade | — | Woda ultraczysta, odgazowana, typ I (18,2 MΩ·cm) |
| Cykloheksan | 110-82-7 | Czystość do analizy pestycydów/PAH. Rozpuszczalnik ekstrakcyjny |
| Standard mieszaniny 15/16 PAH | — | Certyfikowany roztwór wzorcowy EPA 610 PAH Mix (Supelco), 10–2000 µg/mL w ACN |
| Na₂SO₄ bezwodny | 7757-82-6 | Wyprażony (400°C, 4h), do suszenia fazy organicznej |
| Dichlorometan (DCM) | 75-09-2 | Alternatywny rozpuszczalnik ekstrakcyjny, czystość pesticides grade |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- WWA (benzo(a)piren) — rakotwórcze! Unikać kontaktu ze skórą. Podwójne rękawice nitrylowe
- Cykloheksan — łatwopalny, drażniący. Praca w dygestorium, z dala od źródeł zapłonu
- Acetonitryl — toksyczny, łatwopalny. Metabolizowany do HCN. Praca w dygestorium
- Dichlorometan — możliwy kancerogen. Pary cięższe od powietrza. Dygestorium obowiązkowe
- Roztwory wzorcowe PAH — rozcieńczone, ale zawierają kancerogeny. Rękawice, unikać rozlania
- Odpady organiczne — zbierać oddzielnie (halogenowane i niehalogenowane)