🍎 Witamina C — HPLC
Oznaczanie kwasu askorbinowego (witaminy C) w żywności metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z detekcją UV. Kluczowy parametr wartości odżywczej.
Przegląd
Witamina C (kwas L-askorbinowy) jest niezbędnym składnikiem odżywczym, antyoksydantem i jednym z najczęściej deklarowanych składników na etykietach żywności. Metoda PN-EN 14130 jest referencyjną metodą chromatograficzną (HPLC-UV) przeznaczoną do oznaczania sumy kwasu askorbinowego i kwasu dehydroaskorbinowego (po redukcji DTT) w produktach spożywczych.
Metoda polega na ekstrakcji witaminy C z próbki kwasem metafosforowym (stabilizator), redukcji formy utlenionej (DHAA) ditiotreitolem (DTT), rozdziale na kolumnie C18 z fazą ruchomą buforową i detekcji UV przy 245 nm. Zakres oznaczania: 1–1000 mg/100 g.
Zasada metody
Próbka jest homogenizowana z roztworem kwasu metafosforowego (HPO₃) zapobiegającym utlenianiu witaminy C. Po odwirowaniu supernatant jest traktowany DTT (ditiotreitol) w celu redukcji DHAA do kwasu askorbinowego. Roztwór jest filtrowany (0,22 µm) i analizowany HPLC na kolumnie C18 z fazą ruchomą: KH₂PO₄ 50 mmol/L, pH 2,5. Detekcja UV przy 245 nm. Ilościowe oznaczenie z krzywej kalibracyjnej (kwas L-askorbinowy, CRM).
Zastosowania
- Kontrola etykietowania żywności — deklaracja wit. C (Rozp. UE 1169/2011)
- Badanie soków owocowych i warzywnych
- Analiza wzbogaconej żywności i suplementów diety
- Kontrola jakości żywności dla niemowląt
- Badanie trwałości — degradacja wit. C w czasie
- Analiza owoców i warzyw świeżych i mrożonych
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Zakres oznaczania | 1–1000 mg/100 g |
| Granica wykrywalności | 0,5 mg/100 g |
| Długość fali detekcji | 245 nm |
| Precyzja (CV) | 2–5% |
| Czas analizy | 10–15 min/próbka |
Norma
- Numer normy
- PN-EN 14130:2004
- Tytuł (PL)
- Artykuły żywnościowe — Oznaczanie witaminy C metodą HPLC
- Title (EN)
- Foodstuffs — Determination of vitamin C by HPLC
Procedura krok po kroku
1. Ekstrakcja
Odważ 5–10 g próbki. Dodaj 50 mL 3% HPO₃. Homogenizuj 2 min. Odwiruj 10 000 g / 10 min.
2. Redukcja DHAA
Do 5 mL supernatantu dodaj 1 mL DTT (40 mg/mL). Inkubuj 30 min w ciemności w temp. pokojowej.
3. Filtracja
Przefiltruj przez filtr 0,22 µm PVDF do fiolki HPLC.
4. Kalibracja
Przygotuj wzorce kwasu askorbinowego: 5, 10, 25, 50, 100 mg/L w 3% HPO₃.
5. Analiza HPLC
Kolumna C18, faza ruchoma: KH₂PO₄ 50 mM pH 2,5 + 2% MeOH, przepływ 1 mL/min, detekcja 245 nm.
6. Obliczenia
Odczytaj stężenie z krzywej kalibracyjnej. Przelicz na mg/100 g próbki. Uwzględnij rozcieńczenie.
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| System HPLC z detektorem UV/DAD | Agilent 1260 Infinity II, Shimadzu Nexera, Waters Alliance | 200 000–400 000 PLN |
| Kolumna C18 | Waters Atlantis T3 150×4,6 mm, 5 µm | 2 000–4 000 PLN |
| Autosampler | Wbudowany w system HPLC | wbudowany |
| Wirówka laboratoryjna | Eppendorf 5804R, Hettich Rotina 380R | 10 000–30 000 PLN |
| Homogenizator | IKA Ultra-Turrax T25, Kinematica PT 3100 | 5 000–15 000 PLN |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| Kwas L-askorbinowy (wzorzec) | 50-81-7 | Czystość ≥99%, certyfikowany CRM do kalibracji |
| Kwas metafosforowy HPO₃ | 37267-86-0 | Roztwór 3–5%, stabilizator wit. C, zapobiega utlenianiu |
| Ditiotreitol (DTT) | 3483-12-3 | Reduktant DHAA → kwas askorbinowy, roztwór 40 mg/mL |
| Diwodorofosforan potasu KH₂PO₄ | 7778-77-0 | Faza ruchoma: 50 mmol/L, pH 2,5 (zakwaszone H₃PO₄) |
| Metanol HPLC grade | 67-56-1 | Dodatek do fazy ruchomej (2–5%) |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- Kwas metafosforowy — drażniący, rękawice i okulary ochronne
- Metanol — toksyczny, łatwopalny. Pracować pod dygestorium.
- DTT — drażniący, nieprzyjemny zapach. Pracować pod wyciągiem.
- Odpady HPLC — zbierać oddzielnie (odpady organiczne)