🦠 Vibrio spp. w żywności
Wykrywanie potencjalnie enteropatogennych Vibrio spp. (V. parahaemolyticus, V. cholerae, V. vulnificus) w żywności metodą namnażania w ASPW i izolacji na agarze TCBS.
Przegląd
Vibrio to rodzaj bakterii Gram-ujemnych, halofilnych (solnolubnych), naturalnie występujących w wodach morskich i estuariowych. Trzy główne gatunki enteropatogenne to: V. parahaemolyticus — najczęstsza przyczyna bakteryjnych zatruć pokarmowych związanych z owocami morza (biegunka, skurcze, gorączka, 12–24 h po spożyciu); V. cholerae — sprawca cholery (szczepy O1 i O139) oraz lżejszych gastroenteritów (szczepy nie-O1/nie-O139); V. vulnificus — najgroźniejszy gatunek, powodujący posocznicę o śmiertelności >50% u osób z chorobami wątroby.
Norma PN-EN ISO 21872-1 opisuje horyzontalną metodę wykrywania tych trzech gatunków Vibrio w żywności (głównie owoce morza: małże, ostrygi, krewetki, ryby) oraz próbkach środowiskowych. Metoda obejmuje namnażanie selektywne w alkalicznej zasolonej wodzie peptonowej (ASPW — Alkaline Saline Peptone Water), izolację na agarze TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar) i drugim podłożu selektywnym, oraz potwierdzenie biochemiczne i/lub molekularne (PCR).
ASPW zapewnia warunki alkaliczne (pH 8,6) i zasolone (NaCl 2–3%) sprzyjające wzrostowi Vibrio, jednocześnie hamując wiele innych bakterii. TCBS agar jest podłożem wysoce selektywnym — sole żółciowe i sacharoza różnicują gatunki Vibrio: V. parahaemolyticus (kolonie zielono-niebieskie, sacharoza-ujemny), V. cholerae (kolonie żółte, sacharoza-dodatni), V. vulnificus (kolonie zielone, sacharoza-ujemny).
Badanie Vibrio nabiera rosnącego znaczenia w związku z ociepleniem klimatu — Vibrio rozprzestrzeniają się na nowe akweny (Morze Bałtyckie, Morze Północne). W UE badanie jest wymagane w ramach kontroli urzędowej owoców morza i małży.
Zasada metody
Próbkę namnażamy w dwóch kolejnych porcjach ASPW (Alkaline Saline Peptone Water, pH 8,6, NaCl 2–3%). Pierwszy etap namnażania: 41,5°C/6 h i/lub 37°C/6 h. Drugi etap: przeniesienie do świeżego ASPW, 41,5°C/18 h (V. parahaemolyticus, V. cholerae) lub 37°C/18 h (V. vulnificus). Wysokie pH i zasolenie ASPW selektywnie promują wzrost Vibrio. Po namnożeniu posiewamy na TCBS agar (37°C/24 h) i drugie podłoże. Na TCBS V. parahaemolyticus tworzy zielono-niebieskie kolonie (sacharoza −), V. cholerae — żółte (sacharoza +), V. vulnificus — zielone (sacharoza −). Potwierdzenie: testy biochemiczne (oksydaza +, wzrost z NaCl, reakcja Voges-Proskauera) i/lub PCR (geny toksyn: tdh, trh dla V. parahaemolyticus; ctx dla V. cholerae).
Zastosowania
- Kontrola jakości owoców morza — małże, ostrygi, omułki, krewetki
- Badanie ryb i przetworów rybnych, szczególnie surowych (sushi, sashimi)
- Monitoring wody morskiej i estuariowej w rejonach pozyskiwania małży
- Kontrola urzędowa importowanych owoców morza
- Postępowanie epidemiologiczne w ogniskach zatruć po spożyciu owoców morza
- Monitoring klimatyczny — śledzenie rozprzestrzeniania Vibrio na nowe akweny (Bałtyk)
- Badanie sałatek i dań z owocami morza (gotowe do spożycia)
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Namnażanie I | 41,5°C/6 h i/lub 37°C/6 h w ASPW |
| Namnażanie II | 41,5°C/18 h lub 37°C/18 h w świeżym ASPW |
| Izolacja | 37°C/24 h na TCBS Agar |
| Podłoże izolacyjne | TCBS Agar (Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose) |
| Typ kolonii | V. parahaemolyticus: zielono-niebieskie; V. cholerae: żółte; V. vulnificus: zielone |
| Potwierdzenie | Oksydaza (+), testy biochemiczne i/lub PCR (tdh, trh, ctx) |
Norma
- Numer normy
- PN-EN ISO 21872-1:2017
- Tytuł (PL)
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda oznaczania Vibrio spp. — Część 1: Wykrywanie potencjalnie enteropatogennych Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae i Vibrio vulnificus
- Title (EN)
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for the determination of Vibrio spp. — Part 1: Detection of potentially enteropathogenic Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus
Procedura krok po kroku
1. Przygotowanie próbki
Odważ 25 g próbki (owoce morza) do woreczka stomachera. Dodaj 225 mL ASPW (pH 8,6). Homogenizuj 60–120 s.
2. Namnażanie — etap I
Inkubuj w 41,5 ± 1°C przez 6 h (V. parahaemolyticus, V. cholerae). Równolegle możesz inkubować drugą porcję w 37 ± 1°C przez 6 h (V. vulnificus).
3. Namnażanie — etap II
Przenieś 1 mL z namnożonej kultury do 10 mL świeżego ASPW. Inkubuj 41,5°C/18 h (V. parahaemolyticus, V. cholerae) lub 37°C/18 h (V. vulnificus).
4. Izolacja na TCBS
Posiej eozę z namnożonego bulionu na płytkę TCBS agar i drugie podłoże selektywne (np. chromogenne). Inkubuj 37 ± 1°C przez 24 ± 2 h. UWAGA: TCBS agar NIE autoklawować — rozpuścić przez gotowanie i rozlać na płytki.
5. Odczyt kolonii na TCBS
Wyszukaj typowe kolonie: V. parahaemolyticus — zielono-niebieskie, 2–3 mm; V. cholerae — żółte, gładkie, 2–3 mm; V. vulnificus — zielone, 1–2 mm.
6. Przesiew na podłoże nieselektywne
Wybierz min. 3–5 typowych kolonii z każdej płytki. Przesiej na agar z NaCl (TSA + 1% NaCl). Inkubuj 37°C/24 h.
7. Testy potwierdzenia
Wykonaj: test oksydazy (+), test wzrostu z różnym stężeniem NaCl (0%, 3%, 6%, 8%, 10%), test fermentacji sacharozy, reakcja Voges-Proskauera, test string. Lub potwierdź PCR (geny: tlh/tdh/trh dla V. parahaemolyticus; ctx/ompW dla V. cholerae; vvhA dla V. vulnificus).
8. Raportowanie
Wynik: „V. parahaemolyticus / V. cholerae / V. vulnificus wykryto/nie wykryto w 25 g". Podaj gatunek i profil czynników wirulencji (jeśli wykonano PCR).
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| Inkubator laboratoryjny 37°C i 41,5°C | Binder BD 56, Memmert INB 200, POL-EKO CLN 53 | 5 000–18 000 PLN |
| Komora laminarna klasy II | Thermo Scientific MSC-Advantage, ESCO Airstream AC2 | 25 000–60 000 PLN |
| Stomacher / homogenizator | Seward Stomacher 400 Circulator | 12 000–25 000 PLN |
| pH-metr laboratoryjny | Mettler Toledo SevenEasy, WTW inoLab pH 7310 | 3 000–10 000 PLN |
| Autoklaw laboratoryjny | Tuttnauer 2540M, Systec VX-65 | 15 000–45 000 PLN |
| Termocykler PCR (do potwierdzenia molekularnego) | Bio-Rad CFX96, Applied Biosystems 7500 | 40 000–120 000 PLN |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| ASPW (Alkaline Saline Peptone Water) | — | Pepton, NaCl 20–30 g/L, pH 8,6 ± 0,2; do selektywnego namnażania Vibrio; op. 500 g |
| TCBS Agar (Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose) | — | Podłoże wysoce selektywne: tiosiarczan sodu, cytrynian sodu, sole żółciowe, sacharoza, agar; op. 500 g. Nie autoklawować — tylko rozpuścić i rozlać! |
| Sacharoza | 57-50-1 | Składnik TCBS — różnicuje gatunki Vibrio (fermentacja → żółte kolonie) |
| Tiosiarczan sodu | 7772-98-7 | Składnik TCBS — wskaźnik produkcji H₂S |
| Sole żółciowe (Ox Bile) | — | Czynnik selektywny w TCBS hamujący bakterie Gram-dodatnie; 8 g/L |
| Chlorek sodu (NaCl) | 7647-14-5 | Składnik ASPW i podłoży — Vibrio wymaga NaCl do wzrostu (halofilne); 20–30 g/L |
| Odczynnik oksydazowy | — | Do testu potwierdzenia — Vibrio oksydaza-dodatni; paski lub krople |
| Zestawy PCR (tdh, trh, ctx) | — | Do molekularnego potwierdzenia czynników wirulencji; opcjonalnie |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- V. cholerae — patogen BSL-2 (szczepy nie-O1/O139) lub BSL-3 (O1/O139), przestrzegać wytycznych bezpieczeństwa biologicznego
- V. vulnificus — śmiertelność >50% u osób z chorobami wątroby, szczególna ostrożność przy skaleczeniach
- Praca wyłącznie w komorze laminarnej klasy II
- Sole żółciowe w TCBS — drażniące, stosować rękawice i okulary
- Zużyte materiały autoklawować przed utylizacją (121°C/20 min)
- Dezynfekcja powierzchni 70% etanolem — Vibrio wrażliwy na wysuszenie