🌿 Test Microtox® — Vibrio fischeri
Biologiczny test toksyczności wody i ścieków oparty na hamowaniu bioluminescencji bakterii Vibrio fischeri (Aliivibrio fischeri). Szybki screening toksyczności (15–30 min).
Przegląd
Test Microtox® (lub jego odpowiedniki) jest najszybszym i najczęściej stosowanym biotestem do oceny toksyczności wód, ścieków i wyciągów wodnych z gleb i odpadów. Bakteria Vibrio fischeri (dawniej Photobacterium phosphoreum) naturalnie emituje światło (bioluminescencja) dzięki enzymowi lucyferazie. Substancje toksyczne hamują metabolizm bakterii, co powoduje spadek intensywności świecenia.
Wynikiem jest EC50 (stężenie powodujące 50% spadek luminescencji) po 15 i 30 minutach ekspozycji, lub procent hamowania luminescencji dla próbek środowiskowych. Test jest stosowany w klasyfikacji odpadów (toksyczność H14), ocenie toksyczności ścieków i kontroli jakości wody.
Zasada metody
Liofilizowane bakterie Vibrio fischeri są rekonstytuowane w roztworze soli (2% NaCl) i narażane na serię rozcieńczeń próbki. Luminescencja mierzona jest luminometrem przed dodaniem próbki (I₀) i po 5, 15 i 30 minutach ekspozycji (I_t). Procent hamowania = [1 − (I_t/I_kontrola)] × 100. EC50 oblicza się z krzywej dawka-odpowiedź. Temperatura testu: 15°C (optymalna dla V. fischeri).
Zastosowania
- Screening toksyczności ścieków przemysłowych
- Klasyfikacja odpadów pod kątem ekotoksyczności (H14/HP14)
- Ocena toksyczności wyciągów wodnych z gleb skażonych
- Monitoring toksyczności wód powierzchniowych
- Kontrola efektywności procesów oczyszczania ścieków
- Szybka ocena toksyczności chemikaliów (REACH)
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Organizm testowy | Vibrio fischeri (Aliivibrio fischeri), NRRL B-11177 |
| Czas ekspozycji | 15 i 30 min |
| Punkt końcowy | EC50 lub % hamowania luminescencji |
| Temperatura testu | 15 ± 1°C |
| Czas testu | 30–45 min (łącznie z przygotowaniem) |
Norma
- Numer normy
- PN-EN ISO 11348-3:2008
- Tytuł (PL)
- Jakość wody — Oznaczanie hamowania bioluminescencji Vibrio fischeri (test hamowania świecenia) — Część 3: Metoda z zastosowaniem bakterii liofilizowanych
- Title (EN)
- Water quality — Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) — Part 3: Method using freeze-dried bacteria
Procedura krok po kroku
1. Przygotowanie próbki
Dostosuj pH próbki do 6–8 (jeśli konieczne). Dostosuj zasolenie do 2% NaCl. Przefiltruj (0,45 µm) jeśli zawiera zawiesinę.
2. Rekonstytucja bakterii
Dodaj 1 mL schłodzonego roztworu rekonstytucyjnego do ampułki z liofilizatem. Wymieszaj delikatnie. Inkubuj 15 min w 4°C.
3. Przygotowanie rozcieńczeń
Przygotuj serię rozcieńczeń próbki: 100, 50, 25, 12,5, 6,25% w 2% NaCl. Kontrola = 2% NaCl.
4. Pomiar luminescencji I₀
Przenieś bakterie do fiolek pomiarowych (100 µL/fiolkę). Zmierz luminescencję początkową I₀ w luminometrze.
5. Dodanie próbki
Dodaj 900 µL próbki/rozcieńczenia do fiolek z bakteriami. Wymieszaj delikatnie.
6. Pomiar po 15 i 30 min
Zmierz luminescencję I₁₅ i I₃₀. Oblicz % hamowania i EC50.
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| Luminometr Microtox® | Modern Water Microtox M500, LUMIStox 300 (Hach) | 60 000–120 000 PLN |
| Blok chłodzący 15°C | Wbudowany w luminometr lub zewnętrzny | wbudowany |
| Pipety automatyczne | Eppendorf Research Plus 10–1000 µL | 800–2 000 PLN |
| Kuwety/fiolki do luminometru | Fiolki szklane borokrzemowe, op. 500 szt. | 500–1 000 PLN |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| Bakterie V. fischeri liofilizowane | — | Microtox Acute Reagent, ampułki (5 testów/ampułka), przechowywać -20°C |
| Roztwór rekonstytucyjny | — | 2% NaCl, sterylny, schłodzony do 4°C |
| Roztwór rozcieńczający (Diluent) | — | 2% NaCl, do przygotowania rozcieńczeń próbki |
| Substancja referencyjna | 7778-50-9 | Dichromian potasu K₂Cr₂O₇ lub ZnSO₄, do walidacji czułości bakterii |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- Dichromian potasu — rakotwórczy, stosować w dygestorium
- Bakterie V. fischeri — BSL-1, niskie ryzyko biologiczne
- Próbki mogą zawierać substancje toksyczne — rękawice nitrylowe
- Odpady z testu — zbierać do pojemników na odpady biologiczne