🦠 Larwy włośni (Trichinella) w mięsie — metoda wytrawiania sztucznego z mieszadłem magnetycznym

Mikrobiologia PN-EN ISO 18743

Przegląd

ISO 18743:2015 określa metodę wykrywania larw Trichinella w mięsie przez sztuczne wytrawianie z użyciem mieszadła magnetycznego. Próbki muszą być wolne od tłuszczu, ścięgien i powięzi (z języka usuwa się twardą warstwę tkanki łącznej); wielkość próbki indywidualnej ustala właściwy organ, próbki od poszczególnych zwierząt można łączyć — maksymalna masa mięśni w puli do wytrawiania to 100 g, w razie potrzeby do 15 g dodatkowo; przy mniejszej puli (np. 50 g) objętość i skład płynu można proporcjonalnie zmniejszyć do minimum 1 l. Próbki należy pobierać z mięśni predylekcyjnych (u świni — filary przepony lub żwacz; u konia — żwacz, przepona, język; u dzika — przepona, kończyna przednia, język) w masie dwukrotnie większej niż potrzebna do badania, badać jak najszybciej lub przechowywać w 2–8 °C, nie zamrażać. Próbki mrożone (np. monitoring dzikich zwierząt) bada się z wydłużonym czasem sedymentacji do 60 min, bo martwe larwy rozwijają się z kształtu spiralnego i opadają wolniej; wielkość naważki należy wtedy zwiększyć. Wynik podaje się jako obecność lub brak larw Trichinella w x gramach próbki; wszystkie podejrzane znaleziska ogląda się w powiększeniu 60–100×, a dodatnie larwy zaleca się przekazać do identyfikacji mikroskopowej i molekularnej (PCR) do gatunku/genotypu.

W Unii Europejskiej rozporządzenie wykonawcze (UE) 2015/1375 (w brzmieniu po zmianie 2022/1418) wskazuje w załączniku I rozdział I jako metodę referencyjną wykrywania włośni normę ISO 18743:2015, a w rozdziale II opisuje metody równoważne (np. wytrawianie w homogenizatorze Stomacher 3500 z półtora litra wody 40–41 °C, 25 ml 17,5 % HCl i 6 g pepsyny przez 25 min; sito 180 µm o średnicy 11 cm; termometr 0,5 °C w zakresie 20–70 °C; waga ± 0,1 g). Pepsyna ma mieć moc 1:10 000 NF (odpowiada 1:12 500 BP i 2 000 FIP) albo w postaci płynnej co najmniej 660 j./ml; inną aktywność dopuszcza się, jeśli końcowa aktywność płynu odpowiada 10 g pepsyny 1:10 000 NF (pkt 5.3 ISO 18743). Wytyczne Komisji do audytów laboratoriów włośniowych sprawdzają m.in. użycie metody z mieszadłem magnetycznym, oczka sit 180 µm, jakość pepsyny i kwasu oraz czasy sedymentacji. W Polsce norma obowiązuje jako PN-EN ISO 18743:2015-11 ze zmianą A1:2024-02.

Zasada metody

Mięso rozdrabnia się w blenderze/maszynce z dodatkiem 50–100 ml płynu wytrawiającego lub wody wodociągowej (45 ± 2 °C) na 100 g — zwykle trzy impulsy po 5–10 s, nie dłużej, by nie uszkodzić larw. Płyn wytrawiający sporządza się świeżo: do 2 l wody wodociągowej ogrzanej do 45 ± 2 °C dodaje się 16 ml 25 % kwasu solnego (dla 37 % HCl — 11 ml), włącza mieszanie, a następnie 10 g pepsyny w proszku/granulacie (1:10 000 NF) lub 30 ml pepsyny płynnej (660 U/ml); kolejność woda → kwas → pepsyna jest obowiązkowa, bo chroni pepsynę przed rozkładem przez stężony kwas. Rozdrobnione mięso przenosi się do zlewki 3 l z płynem (sprzęt spłukuje się płynem), zlewkę przykrywa folią aluminiową i wytrawia 30 min w 45 ± 2 °C, mieszając tak, by powstał głęboki wir bez rozpryskiwania; czas można wydłużyć maksymalnie do 60 min. Płyn przelewa się przez sito 180–200 µm do rozdzielacza (zlewkę i sito spłukuje się ≥ 100 ml wody); wytrawianie uznaje się za zadowalające, gdy na sicie zostaje głównie tkanka niestrawialna (powięzie, tkanka łączna) w ilości nie większej niż 5 % masy próbki — w przeciwnym razie procedurę powtarza się. Po 30 min sedymentacji szybko i całkowicie otwiera się kran rozdzielacza i spuszcza ok. 40 ml (osad pierwotny) do probówki, odstawia na 10 min, odsysa 30 ml supernatantu, zostawiając ≤ 10 ml (osad wtórny), który przelewa się do kratkowanej płytki Petriego wraz z 10 ml popłuczyn; po co najmniej 1 min sprawdza się przezroczystość (ostrość linii siatki) i ogląda systematycznie, kratka po kratce, pod stereomikroskopem lub trichinoskopem w powiększeniu 10–20× przez co najmniej 10 min; mętny osad klaruje się ponownym rozcieńczeniem do 40 ml, sedymentacją 10 min i odessaniem do 10 ml. Badanie wykonuje się bezpośrednio po wytrawianiu (najpóźniej tego samego dnia, płytka w lodówce); znalezione larwy przenosi się do fiolki 1–2 ml z 70–90 % etanolem.

Zastosowania

• Urzędowe badanie mięsa świń, koni i dzików na obecność włośni w rzeźniach i zakładach rozbioru (metoda referencyjna wg rozporządzenia (UE) 2015/1375)
• Badanie próbek zbiorczych do 100 g (np. 100 próbek po 1 g) z możliwością dochodzenia do tuszy źródłowej przez wytrawianie coraz mniejszych pul
• Monitoring zwierząt dzikich (lisy, jenoty, niedźwiedzie) — także próbek mrożonych z wydłużoną sedymentacją
• Laboratoria weterynaryjne i urzędowe podlegające audytom wg wytycznych Komisji Europejskiej
• Dokumentacja jakości: karta laboratoryjna (numer partii pepsyny, czas wytrawiania, resztki na sicie, wynik)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 18743:2015-11 + A1:2024-02 (ISO 18743:2015 + Amd 1:2023)

Tytuł (PL)

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Wykrywanie larw włośni Trichinella w mięsie metodą wytrawiania

Title (EN)

Microbiology of the food chain — Detection of Trichinella larvae in meat by artificial digestion method

Procedura krok po kroku

1. Pobranie i przygotowanie próbek

   Pobierz mięśnie predylekcyjne (świnia: filary przepony lub żwacz) w masie dwukrotnie większej niż do badania; usuń tłuszcz, ścięgna, powięzie. Sprawdź masę, stan i oznakowanie; badaj od razu lub przechowuj w 2–8 °C bez zamrażania. Pula do wytrawiania: maks. 100 g (+ do 15 g).

2. Rozdrobnienie

   Rozdrobnij mięso w blenderze/maszynce z 50–100 ml płynu wytrawiającego lub wody 45 ± 2 °C na 100 g, zwykle trzema impulsami po 5–10 s — nie dłużej, by nie uszkodzić larw.

3. Płyn wytrawiający (świeży)

   Do 2 l wody wodociągowej 45 ± 2 °C w zlewce dodaj 16 ml 25 % HCl (11 ml przy 37 %), włącz mieszanie na mieszadle magnetycznym, dodaj 10 g pepsyny 1:10 000 NF lub 30 ml pepsyny płynnej 660 U/ml. Kolejność: woda, kwas, pepsyna.

4. Wytrawianie

   Przenieś mięso do zlewki 3 l z płynem, spłucz blender płynem, przykryj folią, utrzymuj 45 ± 2 °C (kontroluj termometrem) i mieszaj tak, by powstał głęboki wir bez rozpryskiwania. Wytrawiaj 30 min; w razie potrzeby wydłuż, maksymalnie do 60 min łącznie.

5. Filtracja

   Przy zamkniętym kranie przelej płyn przez sito 180–200 µm do rozdzielacza; spłucz zlewkę i sito ≥ 100 ml wody. Jeśli na sicie zostało więcej niż 5 % masy próbki lub niestrawione mięśnie — powtórz wytrawianie (resztę dotraw i zbadaj dodatkowo albo pobierz nowe próbki).

6. Sedymentacja i zbieranie osadu

   Sedymentuj 30 min (można delikatnie opukiwać lejek co 10 min; próbki mrożone — do 60 min). Otwórz kran szybko i całkowicie, spuść ok. 40 ml osadu pierwotnego do probówki, odstaw 10 min, odessij 30 ml supernatantu, zostawiając ≤ 10 ml osadu wtórnego (przy mętności: dodaj 30 ml wody, 10 min, powtórz).

7. Badanie mikroskopowe

   Przelej osad wtórny do kratkowanej płytki Petriego, spłucz probówkę 10 ml wody, odczekaj ≥ 1 min. Sprawdź przezroczystość (ostrość siatki); w razie potrzeby sklaruj (uzupełnij do 40 ml, 10 min, odessij do 10 ml). Oglądaj kratka po kratce w 10–20× przez ≥ 10 min bez poruszania płynu; podejrzane obiekty w 60–100×. Badaj od razu, najpóźniej tego samego dnia (płytka w lodówce).

8. Wynik i postępowanie z dodatnimi

   Podaj obecność/brak larw Trichinella w x g. Larwy przenieś do fiolki 1–2 ml z 70–90 % etanolem i przekaż do identyfikacji (mikroskopia, PCR). Przy dodatniej puli wytrawiaj coraz mniejsze pule większych próbek aż do wskazania tuszy. Wypełnij kartę laboratoryjną (pepsyna — nr partii, czas wytrawiania, resztki na sicie, wynik).

9. Dekontaminacja

   Płyny, popłuczyny, szkło i sprzęt mogące zawierać larwy odkaź przez ogrzanie do ≥ 70 °C lub chemicznie (np. podchloryn sodu 0,01 % aktywnego chloru przez ≥ 3 h) przed wylaniem lub myciem.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Larwy Trichinella są inwazyjne dla człowieka — dekontaminacja wszystkich płynów i sprzętu (≥ 70 °C lub podchloryn), rękawice, brak jedzenia w pracowni
• Stężony kwas solny (25–37 %) — okulary, rękawice, dygestorium przy odmierzaniu; zawsze dodawać kwas do wody
• Pepsyna w proszku — unikać wdychania (uczulenia); pepsynę dodawać po kwasie, nigdy do stężonego kwasu
• Gorący płyn 45 °C i mieszadło z płytą grzejną — ostrożnie przy przelewaniu do rozdzielacza
• Szkło o dużej pojemności (zlewki 3 l, rozdzielacze 2,5 l) — ryzyko stłuczenia i rozlania materiału zakaźnego

Najczęstsze pytania