Zarejestruj się
LabCoda / Baza Wiedzy / STEC/VTEC — E. coli werotoksyczne

🧬 STEC/VTEC — E. coli werotoksyczne

Mikrobiologia PN-EN ISO 13136

Wykrywanie E. coli wytwarzających toksynę Shiga (STEC/VTEC) w żywności metodą real-time PCR — detekcja genów wirulencji (stx1, stx2, eae) i oznaczanie serogrup O157, O111, O26, O103, O145.

Przegląd

STEC (Shiga toxin-producing Escherichia coli), znane również jako VTEC (Verocytotoxin-producing E. coli), to patogenne szczepy E. coli wytwarzające toksyny Shiga (Stx1 i/lub Stx2) — jedne z najgroźniejszych patogenów przenoszonych przez żywność. Zakażenie STEC może prowadzić do krwotocznego zapalenia okrężnicy (bloody diarrhea) i zespołu hemolityczno-mocznicowego (HUS — Hemolytic Uremic Syndrome) z niewydolnością nerek, małopłytkowością i niedokrwistością hemolityczną. Śmiertelność HUS wynosi 3–5%, a trwałe uszkodzenie nerek występuje u 25% dzieci z HUS.

Najgroźniejsze serogrupy (tzw. „Top 5" lub „Big 6") to: O157 (najczęstsza, najlepiej poznana), O26, O111, O103 i O145. Źródłem zakażenia jest najczęściej mięso wołowe (surowe lub niedogotowane), niepasteryzowane mleko, surowe kiełki (lucerna, brokuły), sałaty i woda. Dawka zakaźna jest ekstremalnie niska — wystarczy 10–100 komórek.

Norma PN-EN ISO/TS 13136 opisuje molekularną metodę wykrywania STEC opartą na real-time PCR. Jest to jedyna znormalizowana metoda PCR dla STEC w żywności. Metoda obejmuje: namnażanie próbki (18–24 h), ekstrakcję DNA, detekcję genów wirulencji (stx1, stx2 — geny toksyn Shiga; eae — gen intiminy, białka adhezji) oraz oznaczenie serogrup (O157, O111, O26, O103, O145) za pomocą PCR w czasie rzeczywistym.

Jeśli wykryto geny stx i eae oraz serotyp z „Top 5" — wymagana jest izolacja szczepu, często z wykorzystaniem separacji immunomagnetycznej (IMS). Badanie jest obligatoryjne w UE dla kiełków i nasion do kiełkowania (Rozporządzenie (WE) 2073/2005) oraz mięsa mielonego wołowego w niektórych krajach. Kryzys epidemiczny STEC O104:H4 w Niemczech w 2011 r. (kiełki kozieradki, >4000 zachorowań, 54 zgony) znacząco wzmocnił wymagania badawcze.

Zasada metody

Metoda trzyetapowa: (1) Namnażanie — próbkę inkubuje się w bulionie namnażającym (np. BPW lub mTSB z nowobiocyną) w 37°C/18–24 h. (2) Ekstrakcja DNA — z namnożonej kultury izoluje się DNA (termoliza lub zestawy ekstrakcyjne). (3) Real-time PCR — prowadzi się reakcje PCR w czasie rzeczywistym z sondami fluorescencyjnymi (TaqMan) do detekcji: genów stx1 i stx2 (toksyny Shiga), genu eae (intimina — adhezja do enterocytów), oraz genów serogrupowych (wzgA-O157, wzx-O111, wzx-O26, wzx-O103, wzx-O145). Jeśli próbka jest pozytywna na stx + eae + serogrupa „Top 5" — izoluje się szczep STEC, często przy pomocy IMS (immunomagnetic separation) z kulkami opłaszczonymi przeciwciałami anty-O.

Zastosowania

Kluczowe parametry

ParametrWartość
Namnażanie37 ± 1°C, 18–24 h w BPW lub mTSB + nowobiocyna
Metoda detekcjiReal-time PCR (qPCR) z sondami TaqMan
Geny wirulencjistx1, stx2 (toksyny Shiga), eae (intimina)
SerogrupyO157, O111, O26, O103, O145
Izolacja (opcjonalnie)IMS (separacja immunomagnetyczna) + posiew na CT-SMAC / chromogenne
Czułość1–10 jtk/25 g (po namnożeniu)

Norma

Numer normy
PN-EN ISO/TS 13136:2013
Tytuł (PL)
Mikrobiologia żywności i pasz — Metoda reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność — Horyzontalna metoda wykrywania Escherichia coli wytwarzających toksynę Shiga (STEC) oraz oznaczania serogrup O157, O111, O26, O103 i O145
Title (EN)
Microbiology of food and animal feed — Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based method for the detection of food-borne pathogens — Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups

Procedura krok po kroku

1. Przygotowanie próbki i namnażanie

Odważ 25 g próbki, dodaj 225 mL bulionu namnażającego (BPW lub mTSB z nowobiocyną). Homogenizuj w stomacherze. Inkubuj 37 ± 1°C przez 18–24 h.

⏱ Czas: 18–24 h • 🌡 Temperatura: 37°C

2. Ekstrakcja DNA

Pobierz 1 mL namnożonej kultury. Wyizoluj DNA za pomocą zestawu ekstrakcyjnego (kolumny krzemionkowe, kulki magnetyczne lub termoliza: 100°C/10 min). Zmierz stężenie i czystość DNA (opcjonalnie).

⏱ Czas: 30–60 min

3. PCR screening — geny wirulencji

Przygotuj 3 reakcje PCR (simpleks lub multipleks): stx1, stx2, eae. Dodaj DNA, primery, sondy TaqMan, Master Mix. Program: 95°C/10 min → 40 cykli (95°C/15 s, 60°C/60 s). Analizuj krzywe fluorescencji — Ct < 35 = wynik pozytywny.

⏱ Czas: 90 min

4. PCR screening — serogrupy (jeśli stx+)

Jeśli wykryto stx1 i/lub stx2 — przygotuj 5 reakcji PCR dla serogrup: O157, O111, O26, O103, O145. Ten sam program termiczny. Wynik pozytywny = Ct < 35.

⏱ Czas: 90 min

5. Interpretacja screeningu

Warianty: (A) stx+ / eae+ / serogrupa Top5+ → próbka potencjalnie pozytywna, wymagana izolacja szczepu. (B) stx+ / eae− lub serogrupa ujemna → STEC obecne, ale nie Top5, raportuj. (C) stx− → próbka negatywna.

6. Izolacja szczepu (IMS)

Dla wariantu (A): dodaj 20 uL kulek immunomagnetycznych (anti-O odpowiedniej serogrupy) do 1 mL namnożonej kultury. Inkubuj 15–30 min z mieszaniem. Separuj na magnetsie. Płucz 3x. Posiej na CT-SMAC (O157) lub agar chromogenny.

⏱ Czas: 2 h

7. Potwierdzenie izolatu

Z płytki CT-SMAC/chromogennej wybierz typowe kolonie (O157: sorbitol-, bezbarwne). Potwierdź PCR — izolat musi posiadać stx1/stx2 + eae + odpowiedni gen serogrupowy. Opcjonalnie: aglutynacja lateksowa (anty-O157, etc.).

⏱ Czas: 24 h

8. Raportowanie

Wynik screeningu: „STEC (stx+) wykryto/nie wykryto w 25 g". Jeśli izolowano szczep: „STEC O157:H7 (stx2+, eae+) wyizolowano z 25 g próbki". Wynik pozytywny w żywności = powiadomienie RASFF.

⏱ Czas: 10 min

Wymagany sprzęt i aparatura

SprzętPrzykładOrientacyjna cena
Termocykler real-time PCRBio-Rad CFX96 Touch, Applied Biosystems 7500 Fast, Roche LightCycler 48060 000–180 000 PLN
System IMS (separacja immunomagnetyczna)Dynabeads anti-E. coli O157 + separator magnetyczny (Dynal MPC-S)5 000–15 000 PLN (separator) + 2 000–4 000 PLN/kit kulki
Wirówka laboratoryjnaEppendorf 5424 R, Hettich Mikro 200 R8 000–25 000 PLN
Komora PCR (pre-PCR)Biosan UVT-S-AR, ESCO PCR Cabinet5 000–15 000 PLN
Zestaw do ekstrakcji DNAQiagen DNeasy Food Kit, Promega Wizard, PrepMan Ultra1 500–3 000 PLN / 50 ekstrakcji
Inkubator 37°CBinder BD 56, Memmert INB 2005 000–18 000 PLN
Komora laminarna klasy IIThermo Scientific MSC-Advantage25 000–60 000 PLN

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

OdczynnikCASSzczegóły
Zestawy real-time PCR dla STEC (stx1, stx2, eae)—Zestawy z primerami, sondami TaqMan i kontrolami: np. Bio-Rad iQ-Check STEC VirA, Romer RapidFinder STEC, Merck GeneDisc STEC; op. 96 reakcji
Zestawy PCR do serogrup (O157, O111, O26, O103, O145)—Osobne lub multipleksowe zestawy z primerami/sondami dla genów wzx/wzy; op. 96 reakcji
Master Mix PCR (polimeraza + dNTP + bufor)—Np. Bio-Rad SsoAdvanced Universal Probes Supermix, TaqMan Universal Master Mix; op. 200 reakcji
Zestaw do ekstrakcji DNA—Kolumny krzemionkowe lub kulki magnetyczne; np. Qiagen DNeasy, Promega Wizard; op. 50 ekstrakcji
mTSB + nowobiocyna (bulion namnażający)—Zmodyfikowany bulion tryptozowo-sojowy z nowobiocyną (20 mg/L) — selektywne namnażanie STEC; op. 500 g + suplementy
Kulki immunomagnetyczne (IMS)—Dynabeads anti-E. coli O157, O26, O111, O103, O145; op. 5 mL (50 reakcji)
CT-SMAC Agar (Cefixime Tellurite Sorbitol MacConkey)—Podłoże do izolacji E. coli O157 (sorbitol-ujemne); op. 500 g + suplementy
Woda peptonowa buforowana (BPW)—Alternatywny bulion namnażający, op. 500 g

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

🔍 Znajdź laboratorium wykonujące to badanie