🦠 STEC (E. coli wytwarzające toksynę Shiga) w żywności i paszach — namnażanie, real-time PCR genów stx/eae i serogrup, izolacja

Mikrobiologia ISO/TS 13136

Przegląd

ISO/TS 13136:2012 opisuje identyfikację Escherichia coli wytwarzających toksynę Shiga (STEC) przez wykrywanie głównych genów wirulencji stx i eae oraz genów związanych z serogrupami O157, O111, O26, O103 i O145 — serogrupami odpowiedzialnymi za większość ciężkich postaci choroby, w tym zespół hemolityczno-mocznicowy (HUS). Gdy wykryto jeden lub oba geny stx, podejmuje się izolację szczepu; izolację z próbek dodatnich na geny serogrup można ułatwić technikami namnażania swoistego dla serogrupy (np. separacja immunomagnetyczna, IMS). Technologią referencyjną wykrywania genów jest real-time PCR. Specyfikacja ma zastosowanie do produktów przeznaczonych do spożycia przez ludzi i żywienia zwierząt oraz próbek środowiskowych z produkcji i obrotu żywnością i z produkcji pierwotnej. Wymagania ogólne badań mikrobiologicznych określa ISO 7218.

Rozporządzenie (WE) nr 2073/2005 (kryterium 1.29) wymaga dla kiełków niewykrycia STEC O157, O26, O111, O103, O145 oraz O104:H4 w 25 g, wskazując jako metodę referencyjną CEN/ISO TS 13136. Metoda obejmuje pięć kolejnych etapów: namnażanie mikrobiologiczne, ekstrakcję kwasu nukleinowego, wykrywanie genów wirulencji, wykrywanie genów serogrup i izolację z próbek dodatnich (schemat w załączniku A; startery i sondy w załączniku E; alternatywnie klasyczny PCR z detekcją w żelu agarozowym).

Zasada metody

Namnażanie: liczbę komórek STEC zwiększa się inkubując naważkę w nieselektywnym podłożu płynnym — zmodyfikowanym bulionie tryptonowo-sojowym (TSB z 1,5 g/l soli żółciowych nr 3, mTSB) z 16 mg/l nowobiocyny (mTSB+N) dla matryc o wysokiej mikroflorze towarzyszącej, zbuforowanej wodzie peptonowej (BPW) dla próbek z komórkami zestresowanymi (np. mrożonych) i niższą mikroflorą, albo mTSB z 12 mg/l akryflawiny (mTSB+A) dla mleka i przetworów mlecznych; nowobiocyna i akryflawina hamują bakterie Gram-dodatnie. Norma zaznacza, że dodatek nowobiocyny jest dyskusyjny — w zwykłym stężeniu 20 mg/l (ISO 16654) hamuje wzrost ok. jednej trzeciej szczepów nie-O157, stąd obniżone 16 mg/l. Ekstrakcja: kwas nukleinowy ekstrahuje się zgodnie z wymaganiami przyjętego systemu detekcji. Geny docelowe: geny stx (stx1 i stx2; z siedmiu wariantów stx2 celem są stx2a, stx2b i stx2c — GenBank X07865, L11078, M59432), gen eae kodujący intiminę (białko 90 kDa odpowiedzialne za mechanizm adhezji „attaching and effacing” typowy dla STEC wywołujących ciężką chorobę) oraz geny serogrup: rfbE (O157), wbdI (O111), wzx (O26), ihp1 (O145) i wzx (O103). Wykrywanie: real-time PCR wg przyjętego systemu. Izolacja: przy podejrzeniu STEC podejmuje się izolację — po wykryciu jednej z serogrup z zakresu można wykonać namnażanie swoiste (np. IMS) i posiew na agar tryptonowo-żółciowo-glukuronidowy (TBX) lub swoiste podłoże selektywne (załącznik F), aby ułatwić wyizolowanie STEC spośród flory towarzyszącej.

Zastosowania

• Kiełki (rozporządzenie 2073/2005, kryterium 1.29 — STEC O157, O26, O111, O103, O145, O104:H4 nieobecne w 25 g)
• Mleko i przetwory mleczne (wariant namnażania mTSB+A z akryflawiną)
• Produkty mrożone i o niskiej mikroflorze towarzyszącej (namnażanie w BPW)
• Próbki środowiskowe z produkcji pierwotnej, zakładów produkcji i obrotu żywnością
• Badania urzędowe i dochodzenia ogniskowe — szybkie badanie przesiewowe PCR z następczą izolacją szczepu

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

ISO/TS 13136:2012 (CEN ISO/TS 13136:2012)

Tytuł (PL)

Mikrobiologia żywności i pasz — Metoda oparta na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym do wykrywania mikroorganizmów chorobotwórczych przenoszonych przez żywność — Horyzontalna metoda wykrywania Escherichia coli wytwarzających toksynę Shiga (STEC) i określania serogrup O157, O111, O26, O103 i O145 (tłumaczenie robocze)

Title (EN)

Microbiology of food and animal feed — Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based method for the detection of food-borne pathogens — Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups

Procedura krok po kroku

1. Wybór bulionu i namnażanie

   Naważkę (np. 25 g kiełków) zhomogenizuj w bulionie dobranym do matrycy: mTSB+N (16 mg/l nowobiocyny) przy wysokiej mikroflorze, BPW przy komórkach zestresowanych (mrożonki), mTSB+A (12 mg/l akryflawiny) dla mleka i przetworów; inkubuj wg normy.

2. Ekstrakcja DNA

   Z namnożonej hodowli wyekstrahuj kwas nukleinowy zgodnie z wymaganiami przyjętego systemu detekcji.

3. Real-time PCR — geny wirulencji

   Wykryj geny stx (stx1, stx2 — warianty stx2a/b/c) i eae z użyciem starterów i sond z załącznika E; oceń wynik wg przyjętego systemu.

4. Real-time PCR — geny serogrup

   W próbkach dodatnich na stx wykryj geny rfbE (O157), wbdI (O111), wzx (O26), ihp1 (O145) i wzx (O103).

5. Izolacja

   Gdy wykryto stx: podejmij izolację szczepu; po wykryciu serogrupy z zakresu wykonaj namnażanie swoiste (np. IMS) i posiej na agar TBX lub swoiste podłoże selektywne (załącznik F); potwierdź geny w izolacie.

6. Wynik

   Podaj wykrycie/niewykrycie STEC (geny stx/eae, serogrupa) w naważce oraz wynik izolacji; dla kiełków odnieś do kryterium 2073/2005 (nieobecne w 25 g).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• STEC (w tym O157) to patogeny o niskiej dawce zakażającej wywołujące HUS — praca w laboratorium o odpowiednim poziomie bezpieczeństwa, ścisła aseptyka, autoklawowanie hodowli
• Akryflawina i nowobiocyna — unikać kontaktu ze skórą i wdychania proszków
• Zapobieganie kontaminacji amplikonami PCR — rozdział stref przed- i po-PCR, kontrole ujemne

Najczęstsze pytania