🦠 Staphylococcus aureus w kosmetykach — wykrywanie po namnażaniu w bulionie z neutralizatorami i izolacji na agarze Baird-Parkera

Mikrobiologia PN-EN ISO 22718

Przegląd

Badania mikrobiologiczne kosmetyków prowadzi się zgodnie z analizą ryzyka mikrobiologicznego, zależną od możliwej zmiany produktu, chorobotwórczości drobnoustrojów, miejsca stosowania (włosy, skóra, oczy, błony śluzowe) i użytkowników (dorośli, dzieci do 3 lat). Wykrywanie patogenów skórnych — Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa i Candida albicans — jest istotne, bo mogą wywoływać zakażenia skóry lub oczu. ISO 22718:2015 (drugie wydanie, drobna rewizja ISO 22718:2006) podaje ogólne wytyczne wykrywania i identyfikacji S. aureus w produktach kosmetycznych; produkty o niskim ryzyku (niska aktywność wody, produkty wodno-alkoholowe, skrajne pH — ISO 29621) mogą nie wymagać badania. Metoda opiera się na wykrywaniu S. aureus w nieselektywnym podłożu płynnym (bulion namnażający), a następnie izolacji na selektywnym agarze; dla niektórych produktów (np. niemieszających się z wodą) może być nieodpowiednia — wtedy stosuje się ISO 18415 — a metody alternatywne (np. automatyczne) wymagają wykazania równoważności. S. aureus to Gram-dodatnie ziarenkowce w gronach, o gładkich, zwykle żółto pigmentowanych koloniach, katalazo- i koagulazo-dodatnie; to oportunistyczny patogen, który może bytować na skórze zdrowych osób, a w kosmetyku jest niepożądany. W Polsce norma obowiązuje jako PN-EN ISO 22718:2016-01 i jest jedną z podstawowych norm badania czystości mikrobiologicznej kosmetyków (obok PN-EN ISO 21149, 21150, 22717, 18416, 18415).

Zasada metody

Pierwszy etap to namnażanie w nieselektywnym bulionie, aby zwiększyć liczbę drobnoustrojów bez ryzyka zahamowania przez składniki selektywne; drugi — izolacja na podłożu selektywnym i testy identyfikacyjne. Możliwe hamowanie wzrostu przez próbkę musi być zneutralizowane, a skuteczność neutralizacji właściwości przeciwdrobnoustrojowych produktu sprawdzona i wykazana (rozdział 11 normy, neutralizatory w załączniku B). Bulion namnażający Eugon LT 100 zawiera składniki neutralizujące — lecytynę i polisorbat 80 — oraz dyspergujący oktoksynol 9 (skład na 1 l: hydrolizat kazeiny 15 g, hydrolizat soi 5 g, L-cystyna 0,7 g, NaCl 4 g, siarczyn sodu 0,2 g, glukoza 5,5 g, lecytyna jaja 1 g, polisorbat 80 5 g, oktoksynol 9 1 g; pH 7,0 ± 0,2; sterylizacja 121 °C 15 min); dopuszczalne są inne buliony (załącznik A), jeśli wykazano ich przydatność. Selektywny agar Baird-Parkera: podłoże podstawowe (hydrolizat kazeiny 10 g, ekstrakt drożdżowy 1 g, ekstrakt mięsny 5 g, pirogronian sodu 10 g, L-glicyna 12 g, chlorek litu 5 g, agar 12–22 g, woda do 950 ml; pH 7,2 ± 0,2) z dodatkiem roztworu tellurynu potasu (1 g/100 ml, sterylizowany filtracyjnie 0,22 µm, przechowywany do miesiąca w (3 ± 2) °C) i emulsji żółtka jaja (ok. 20 %). Do testu przydatności służy rozcieńczalnik tryptonowo-solny (tryptone 1 g, NaCl 8,5 g/l; pH 7,0 ± 0,2) i agar TSA/SCDA (pH 7,3 ± 0,2); ogólne wytyczne — ISO 21148, szczepy testowe — EN 12353. Woda: destylowana lub oczyszczona wg ISO 21148.

Zastosowania

• Kontrola czystości mikrobiologicznej wyrobów gotowych i surowców w przemyśle kosmetycznym (badanie przed testem konserwacji)
• Kosmetyki do skóry, włosów, oczu i błon śluzowych oraz produkty dla dzieci do 3 lat — patogen skórny o istotnym znaczeniu
• Ocena higieny procesu wytwarzania (dokumentacja produktu kosmetycznego, GMP)
• Badania reklamacyjne i zwolnienia partii; walidacja neutralizacji konserwantów

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 22718:2016-01 (ISO 22718:2015)

Tytuł (PL)

Kosmetyki — Mikrobiologia — Wykrywanie obecności Staphylococcus aureus

Title (EN)

Cosmetics — Microbiology — Detection of Staphylococcus aureus

Procedura krok po kroku

1. Analiza ryzyka i próbka

   Ustal na podstawie analizy ryzyka (ISO 29621), czy produkt wymaga badania; pobierz co najmniej 1 g lub 1 ml produktu jako próbkę do zawiesiny wyjściowej.

2. Zawiesina wyjściowa i namnażanie

   Zdyspreguj próbkę w określonej objętości bulionu namnażającego z neutralizatorami (Eugon LT 100 lub inny o wykazanej przydatności); w razie potrzeby przygotuj rozcieńczenia; inkubuj bulion (rozdz. 9.3 normy).

3. Izolacja

   Z namnożonej hodowli wykonaj posiew na agar Baird-Parkera (lub inne podłoże z załącznika A) i inkubuj; dopuszczalny jest też przesiew na podłoże nieselektywne z następczą identyfikacją zestawami.

4. Identyfikacja

   Kolonie o charakterystycznym wyglądzie na podłożu selektywnym potwierdź testem katalazy i koagulazy (S. aureus: obie dodatnie); w razie wątpliwości użyj zestawów identyfikacyjnych.

5. Test przydatności (neutralizacja)

   Równolegle wykaż, że produkt nie hamuje wzrostu: przygotuj inokulum S. aureus w rozcieńczalniku tryptonowo-solnym, dodaj do próbki z bulionem i porównaj odzysk z kontrolą na TSA (rozdz. 11.3); bez potwierdzenia neutralizacji wynik ujemny jest nieważny.

6. Wynik i sprawozdanie

   Podaj obecność lub brak S. aureus w badanej ilości produktu, zastosowany bulion i podłoże, sposób neutralizacji oraz wynik testu przydatności (rozdz. 10 i 12).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• S. aureus jest patogenem oportunistycznym (zakażenia skóry i oczu) — praca w warunkach laboratorium mikrobiologicznego, dekontaminacja hodowli
• Telluryn potasu jest toksyczny — ważenie i sporządzanie roztworu w rękawicach, unikać pylenia
• Emulsja żółtka jaja — jałowość i higiena przygotowania (dezynfekcja skorupek)

Najczęstsze pytania