🍎 Skład kwasów tłuszczowych olejów i tłuszczów — estry metylowe (FAME), chromatografia gazowa GC-FID

Chemia żywności PN-EN ISO 12966-1

Krótko: o co chodzi

Kwasy tłuszczowe (wolne i związane w acyloglicerolach) przeprowadza się w estry metylowe (wg ISO 12966-2 lub -3), rozdziela na kolumnie kapilarnej (10–100 m, fazy polarne cyjanoalkilopolisiloksanowe do izomerów cis/trans) i wykrywa detektorem płomieniowo-jonizacyjnym; udziały oblicza się z pól pików (normalizacja) lub ze wzorcem wewnętrznym. Badanie wykonuje się według normy PN-EN ISO 12966-1:2015-01; Zakres kwasów: FAME od C4 do C26: nasycone, cis- i trans-mono- oraz polienowe. Procedura obejmuje 8 kroków (łącznie około 1 min); stosuje się je m.in. do: Charakterystyka i identyfikacja olejów roślinnych i tłuszczów zwierzęcych (profil kwasów tłuszczowych, kwasy nasycone, MUFA, PUFA), Oznaczanie izomerów trans i sprzężonych w tłuszczach uwodornionych i smażalniczych, Deklaracja wartości odżywczej żywności po ekstrakcji tłuszczu z matrycy.

W skrócie

Norma: PN-EN ISO 12966-1:2015-01
Kategoria: Chemia żywności
Kroków procedury: 8
Łączny czas etapów: 1 min
Zakres kwasów: FAME od C4 do C26: nasycone, cis- i trans-mono- oraz polienowe
Kolumny: Kapilarne WCOT 10–100 m, średnica wewnętrzna 0,1–0,53 mm, film 0,1–0,3 µm; 0,20–0,32 mm do dozowania split/splitless, 0,53 mm do dozowania bezpośredniego
Faza do izomerów cis/trans: 100 m, 0,20–0,25 mm, film 0,20 µm, biscyjanopropylowa (SP-2560) lub cyjanopropylowa (CP-Sil 88)

Przegląd

Część 1 normy ISO 12966 daje przegląd chromatograficznego oznaczania kwasów tłuszczowych, wolnych i związanych, w olejach i tłuszczach zwierzęcych i roślinnych po ich przekształceniu w estry metylowe (FAME). Ilościowe i jakościowe oznaczanie składu kwasów tłuszczowych metodą chromatografii gazowej jest szeroko stosowane w analizie lipidów — do charakteryzowania tłuszczów i olejów oraz żywności tłuszczowej po wyekstrahowaniu tłuszczu z matrycy. Seria ISO 12966 (części 1–4) zastąpiła ISO 5508, ISO 5509 i ISO 15304; dotyczy tłuszczów surowych, rafinowanych, częściowo i całkowicie uwodornionych oraz kwasów tłuszczowych, nie nadaje się natomiast do tłuszczu mlecznego i przeżuwaczy, produktów wzbogaconych w sprzężony kwas linolowy (CLA) ani tłuszczów spolimeryzowanych i utlenionych. Przygotowanie estrów opisują części 2 (metody chemiczne) i 3 (wodorotlenek trimetylosulfoniowy, TMSH), a warunki analizy kapilarnej — część 4.

Zablokowanie grup karboksylowych w estrach metylowych uniemożliwia tworzenie wiązań wodorowych, co obniża temperatury wrzenia i topnienia w stosunku do kwasów i umożliwia analizę GC. Norma zestawia metody estryfikacji: szybką transmetylację KOH w metanolu (nie estryfikuje wolnych kwasów; także dla tłuszczów z krótkołańcuchowymi kwasami, ryzyko tworzenia mydeł), ogólną transmetylację/metylację NaOCH3 (niezalecana dla olejów laurynowych), metylację BF3 (14 % roztwór metanolowy, kupowany, bardzo toksyczny; dla olejów rybich), metanolowy H2SO4 lub HCl (dla próbek o większej zawartości wolnych kwasów; 3 h w zamkniętej ampułce) oraz TMSH (bardzo szybka, C4–C26, estryfikacja wolnych kwasów ok. 80 %, niewielkie ilości izomerów trans).

Do rozdziału stosuje się kapilary WCOT o średnicy wewnętrznej 0,1–0,53 mm i grubości filmu 0,1–0,3 µm, o długości 10–100 m zależnie od wymaganej rozdzielczości; podwojenie długości kolumny zwiększa rozdzielczość tylko o czynnik 1,41. Do złożonych mieszanin izomerów geometrycznych i pozycyjnych wielonienasyconych kwasów zalecane są kolumny 100 m z fazą biscyjanopropylową (SP-2560) lub wysoko podstawioną cyjanopropylową (CP-Sil 88). Gazem nośnym przy FID powinien być wodór (przy detektorze mas — hel). W instrukcji Uniwersytetu Gdańskiego analiza FAME smalcu prowadzona jest na kolumnie RTX-5 30 m × 0,25 mm × 0,25 µm z programem temperatury 120–220 °C.

Zasada metody

Estry metylowe przygotowane według ISO 12966-2 lub ISO 12966-3 (np. transestryfikacja roztworu tłuszczu w izooktanie metanolowym roztworem KOH z następczą neutralizacją kwaśnym siarczanem sodu) rozpuszczone w rozpuszczalniku wstrzykuje się do dozownika, gdzie odparowują; rozdział zachodzi na kolumnie kapilarnej o dobranej polarności i długości, a substancje opuszczają kolumnę w charakterystycznych czasach retencji, porównywanych z czasami retencji mieszaniny wzorcowej FAME. Detekcja: detektor płomieniowo-jonizacyjny (FID). Udziały procentowe kwasów tłuszczowych oblicza się z pól pików metodą normalizacji wewnętrznej (pole piku jako procent sumy) albo dokładniej ze wzorcem wewnętrznym lub współczynnikami korekcji odpowiedzi. Przy detektorze mas należy uwzględnić różnice fragmentacji poszczególnych FAME.

Zastosowania

Charakterystyka i identyfikacja olejów roślinnych i tłuszczów zwierzęcych (profil kwasów tłuszczowych, kwasy nasycone, MUFA, PUFA)
Oznaczanie izomerów trans i sprzężonych w tłuszczach uwodornionych i smażalniczych
Deklaracja wartości odżywczej żywności po ekstrakcji tłuszczu z matrycy
Wykrywanie zafałszowań olejów (np. oliwy) i kontrola zgodności ze specyfikacją
Obliczanie liczby jodowej ze składu kwasów tłuszczowych (ISO 3961, załącznik B)

Kluczowe parametry

Parametr	Wartość
Zakres kwasów	FAME od C4 do C26: nasycone, cis- i trans-mono- oraz polienowe
Kolumny	Kapilarne WCOT 10–100 m, średnica wewnętrzna 0,1–0,53 mm, film 0,1–0,3 µm; 0,20–0,32 mm do dozowania split/splitless, 0,53 mm do dozowania bezpośredniego
Faza do izomerów cis/trans	100 m, 0,20–0,25 mm, film 0,20 µm, biscyjanopropylowa (SP-2560) lub cyjanopropylowa (CP-Sil 88)
Gaz nośny	Wodór przy FID (szybszy rozdział, ostrzejsze piki); hel przy detektorze mas
Przykładowe warunki (UG, smalec)	RTX-5 30 m × 0,25 mm × 0,25 µm, dozownik i detektor 300 °C, 120→220 °C z narostem 3 °C/min, argon 1,5 ml/min, nastrzyk 1 µl
Obliczenia	Normalizacja wewnętrzna (% pola) lub wzorzec wewnętrzny / współczynniki korekcji

Norma

Numer normy: PN-EN ISO 12966-1:2015-01
Tytuł (PL): Oleje i tłuszcze roślinne oraz zwierzęce — Chromatografia gazowa estrów metylowych kwasów tłuszczowych — Część 1: Przewodnik do nowoczesnej chromatografii gazowej estrów metylowych kwasów tłuszczowych
Title (EN): Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of fatty acid methyl esters — Part 1: Guidelines on modern gas chromatography of fatty acid methyl esters

Procedura krok po kroku

Wybór metody estryfikacji

Dobrać metodę wg tabeli 1 normy: KOH/metanol (szybka, bez estryfikacji wolnych kwasów), NaOCH3 (nie dla olejów laurynowych), BF3 (oleje rybie), metanolowy H2SO4/HCl (wysoka zawartość wolnych kwasów, 3 h w ampułce) lub TMSH (bardzo szybka, tylko split).
Przygotowanie FAME (przykład UG, KOH)

Do probówki z podziałką wprowadzić 1 ml roztworu tłuszczu w izooktanie (10 mg/ml), dodać 3 ml izooktanu i wytrząsać; dodać 400 µl metanolowego roztworu KOH i energicznie wytrząsać ok. 30 s — po zmętnieniu wydziela się glicerol i mieszanina staje się klarowna.

⏱ Czas: 30 s
Neutralizacja

Dodać ok. 1 g kwaśnego siarczanu sodu, wytrząsnąć; po opadnięciu soli zebrać pipetą górną warstwę z estrami metylowymi do wialki 1,5 ml.
Warunki GC

Zainstalować kolumnę odpowiednią do celu (polarna 100 m do izomerów; w ćwiczeniach RTX-5 30 m), ustawić dozownik i detektor (np. 300 °C), program temperatury (np. 120→220 °C, 3 °C/min), gaz nośny (wodór przy FID; w UG argon 1,5 ml/min).
Analiza wzorca

Wstrzyknąć 1 µl mieszaniny wzorcowej FAME i ustalić czasy retencji poszczególnych estrów; przy 100 m kolumnach polarnych uwzględnić kolejność elucji z ISO 12966-4.
Analiza próbki

Wstrzyknąć 1 µl roztworu FAME próbki w tych samych warunkach; zidentyfikować piki przez porównanie czasów retencji.
Obliczenia

Metodą normalizacji wewnętrznej obliczyć udział procentowy każdego kwasu z pól pików (procent sumy pól) lub zastosować wzorzec wewnętrzny / współczynniki korekcji; wynik można przeliczyć na mg/g produktu.
Sprawozdanie

Podać metodę estryfikacji (część normy), kolumnę i warunki chromatograficzne, sposób obliczeń oraz skład kwasów tłuszczowych.

Wymagany sprzęt i aparatura

Sprzęt	Przykład	Orientacyjna cena
Chromatograf gazowy z FID	Dozownik split/splitless, on-column lub bezpośredni; np. Shimadzu GC-2025 (instrukcja UG)	—
Kolumna kapilarna	Polarna cyjanopropylowa 100 m (SP-2560, CP-Sil 88) do izomerów; niepolarna RTX-5 30 m × 0,25 mm × 0,25 µm w ćwiczeniach UG	—
Źródło gazu nośnego	Wodór (generator lub butla) albo hel; gazy do FID	—
Strzykawka lub autosampler	Strzykawka do GC 10 µl, nastrzyk 1 µl	—
Szkło do estryfikacji	Probówki miarowe z korkiem, wialki 1,5 ml, pipety; ampułki do metody kwasowej	—
Mieszanina wzorcowa FAME	Do ustalenia czasów retencji i identyfikacji pików	—

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Odczynnik	CAS	Szczegóły
Wodorotlenek potasu w metanolu	1310-58-3	Szybka transmetylacja alkaliczna (ISO 12966-2, 4.2); w instrukcji UG: 400 µl na 1 ml roztworu smalcu 10 mg/ml w izooktanie
Metanol	67-56-1	Rozpuszczalnik odczynników metylujących (KOH, NaOCH3, BF3, H2SO4, HCl)
Trifluorek boru, 14 % roztwór metanolowy	7637-07-2	Kupowany, nie przygotowywany samodzielnie ze względu na toksyczność; ograniczona trwałość; do olejów rybich, nie do związków z wtórnymi grupami tlenowymi
Wodorotlenek trimetylosulfoniowy (TMSH)	—	Gotowy roztwór; bardzo szybka metoda C4–C26, tylko dozowanie split; piki produktów ubocznych blisko krótkołańcuchowych FAME
Izooktan	540-84-1	Rozpuszczalnik próbki tłuszczu do estryfikacji (instrukcja UG)
Kwaśny siarczan sodu	—	Do zobojętnienia KOH po transestryfikacji (ok. 1 g), instrukcja UG

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

Trifluorek boru w metanolu jest bardzo toksyczny — pracować tylko w zamkniętych fiolkach i pod wyciągiem
Metanolowe roztwory KOH i kwasów są żrące; metanol toksyczny — okulary, rękawice, wyciąg
Wodór jako gaz nośny — kontrola szczelności instalacji, detektor wycieków; izooktan łatwopalny
Gorący dozownik i detektor (300 °C) — nie dotykać podczas pracy

Najczęstsze pytania

Jaka norma opisuje to badanie?

Badanie wykonuje się według normy PN-EN ISO 12966-1:2015-01 — „Oleje i tłuszcze roślinne oraz zwierzęce — Chromatografia gazowa estrów metylowych kwasów tłuszczowych — Część 1: Przewodnik do nowoczesnej chromatografii gazowej estrów metylowych kwasów tłuszczowych”. Tytuł angielski: „Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of fatty acid methyl esters — Part 1: Guidelines on modern gas chromatography of fatty acid methyl esters”.

Na czym polega ta metoda?

Jaki jest zakres pomiarowy i dokładność?

Zakres kwasów: FAME od C4 do C26: nasycone, cis- i trans-mono- oraz polienowe; Kolumny: Kapilarne WCOT 10–100 m, średnica wewnętrzna 0,1–0,53 mm, film 0,1–0,3 µm; 0,20–0,32 mm do dozowania split/splitless, 0,53 mm do dozowania bezpośredniego; Faza do izomerów cis/trans: 100 m, 0,20–0,25 mm, film 0,20 µm, biscyjanopropylowa (SP-2560) lub cyjanopropylowa (CP-Sil 88); Gaz nośny: Wodór przy FID (szybszy rozdział, ostrzejsze piki); hel przy detektorze mas.

Ile trwa wykonanie badania?

Suma czasów podanych przy poszczególnych etapach to około 1 min. Procedura obejmuje 8 kroków.

Jaki sprzęt jest potrzebny?

Chromatograf gazowy z FID, Kolumna kapilarna, Źródło gazu nośnego, Strzykawka lub autosampler, Szkło do estryfikacji, Mieszanina wzorcowa FAME.

Gdzie stosuje się to badanie?

Charakterystyka i identyfikacja olejów roślinnych i tłuszczów zwierzęcych (profil kwasów tłuszczowych, kwasy nasycone, MUFA, PUFA); Oznaczanie izomerów trans i sprzężonych w tłuszczach uwodornionych i smażalniczych; Deklaracja wartości odżywczej żywności po ekstrakcji tłuszczu z matrycy; Wykrywanie zafałszowań olejów (np. oliwy) i kontrola zgodności ze specyfikacją; Obliczanie liczby jodowej ze składu kwasów tłuszczowych (ISO 3961, załącznik B).

Jakie środki ostrożności obowiązują?

Trifluorek boru w metanolu jest bardzo toksyczny — pracować tylko w zamkniętych fiolkach i pod wyciągiem; Metanolowe roztwory KOH i kwasów są żrące; metanol toksyczny — okulary, rękawice, wyciąg; Wodór jako gaz nośny — kontrola szczelności instalacji, detektor wycieków; izooktan łatwopalny; Gorący dozownik i detektor (300 °C) — nie dotykać podczas pracy.

Które laboratorium wykona to badanie?

Badanie wykonują laboratoria akredytowane według ISO/IEC 17025. Na LabCoda wyszukasz je po numerze normy PN-EN ISO 12966-1.

🔍 Znajdź laboratorium wykonujące to badanie