🦠 Salmonella spp. w wodzie — wykrywanie z przednamnażaniem w BPW, namnażaniem selektywnym (RVS, MKTTn) i posiewem na XLD

Mikrobiologia PN-EN ISO 19250

Przegląd

ISO 19250:2010 określa metodę wykrywania Salmonella spp. (przypuszczalnych lub potwierdzonych) w próbkach wody; do celów epidemiologicznych lub w dochodzeniach ogniskowych mogą być potrzebne dodatkowe podłoża. Norma ostrzega, że metoda może nie odzyskiwać wszystkich szczepów Salmonella ser. Typhi i ser. Paratyphi. Podejście półilościowe jest możliwe przez testy NPL z odpowiednimi objętościami próbki — wtedy dostosowuje się objętość zbuforowanej wody peptonowej. Wykrywanie wymaga czterech kolejnych etapów: przednamnażania (pozwala wykryć małe liczby lub uszkodzone komórki Salmonella; niektóre szczepy wymagają dłuższej inkubacji), namnażania selektywnego (Salmonella występuje w małej liczbie w towarzystwie znacznie liczniejszych innych Enterobacteriaceae), posiewu na podłoża stałe i rozpoznania oraz potwierdzenia. Dla ścieków lepsze wyniki daje krótsze przednamnażanie lub bezpośredni posiew do podłoża selektywnego.

Typowe objętości dla wody do spożycia to 1000–5000 ml, zatężane przez filtrację membranową; dla zanieczyszczonych wód powierzchniowych i ścieków — mniejsze. Próbki trzymane w temperaturze otoczenia bada się w ciągu 12 h od poboru; wyjątkowo dopuszcza się (5 ± 3) °C do 24 h. W Polsce obowiązuje jako PN-EN ISO 19250:2013-07 (wersja polska, data publikacji 20-09-2022). Krajowi dostawcy podłoży oferują do tej normy komplet: zbuforowaną wodę peptonową, bulion RVS, bulion MKTTn, agar XLD oraz surowice do potwierdzeń serologicznych (antygeny somatyczne O i Vi).

Zasada metody

Przednamnażanie: zbuforowaną wodę peptonową (BPW) inokuluje się w temperaturze otoczenia znaną objętością próbki lub jej rozcieńczeń i inkubuje w (36 ± 2) °C przez (18 ± 2) h — objętości poniżej 10 ml dodaje się do 50 ml BPW; objętości powyżej 10 ml filtruje się przez jałowy filtr membranowy o porach 0,45 µm, który zanurza się w 50 ml BPW (dla wód mętnych stosuje się środek filtracyjny, typowo 15 ml na podkładce i 15 ml zmieszane z próbką; końcowa objętość BPW 100 ml); hodowlę można też rozdzielić w serię NPL. Namnażanie selektywne: 0,1 ml hodowli przenosi się do 10 ml bulionu Rappaporta-Vassiliadisa z soją (RVS) inkubowanego w (41,5 ± 1,0) °C przez (24 ± 3) h (nie przekraczać 42,5 °C), a w razie potrzeby wykrycia wolno rosnących szczepów — dalsze (24 ± 3) h do łącznie (48 ± 4) h; równolegle 1 ml do 10 ml bulionu tetrationianowego Müllera-Kauffmanna z nowobiocyną (MKTTn), inkubowanego w (36 ± 2) °C przez (24 ± 3) h (MKTTn odzyskuje większość szczepów, w tym część S. Paratyphi, ale nie S. Paratyphi C; nie stosuje się go, gdy po bulionie selenitowo-cystynowym podejrzewa się S. Typhi). Posiew: z każdej hodowli selektywnej posiewa się agar ksylozowo-lizynowo-deoksycholanowy (XLD) inkubowany dnem do góry w (36 ± 2) °C i oglądany po (24 ± 3) h w poszukiwaniu kolonii przypuszczalnych Salmonella, oraz drugie stałe podłoże selektywne komplementarne do XLD, w miarę potrzeby odpowiednie dla szczepów laktozo-dodatnich, S. Typhi i S. Paratyphi (np. agar z zielenią brylantową, agar z siarczynem bizmutu), inkubowane wg zaleceń producenta. Potwierdzenie: kolonie przypuszczalne przesiewa się i potwierdza odpowiednimi testami biochemicznymi i serologicznymi.

Zastosowania

• Woda do spożycia i wody podziemne — duże objętości 1000–5000 ml zatężane przez filtrację membranową
• Zanieczyszczone wody powierzchniowe i ścieki (mniejsze objętości; dla ścieków krótsze przednamnażanie lub posiew bezpośredni)
• Dochodzenia epidemiologiczne i ogniskowe (z dodatkowymi podłożami; uwaga na S. Typhi i S. Paratyphi)
• Półilościowe oznaczenie NPL Salmonella z serią objętości próbki
• Kontrola skuteczności uzdatniania i oczyszczania w laboratoriach wodociągowych i sanitarnych

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 19250:2013-07 (ISO 19250:2010)

Tytuł (PL)

Jakość wody — Wykrywanie Salmonella spp.

Title (EN)

Water quality — Detection of Salmonella spp.

Procedura krok po kroku

1. Pobór i przechowywanie

   Pobierz próbkę i rozpocznij badanie w ciągu 12 h (temperatura otoczenia); wyjątkowo przechowuj w (5 ± 3) °C do 24 h. Dobierz objętość: woda do spożycia 1000–5000 ml, wody zanieczyszczone i ścieki — mniej.

2. Przednamnażanie — objętości < 10 ml

   Zaszczep 50 ml BPW próbką lub jej rozcieńczeniem w temperaturze otoczenia i inkubuj w (36 ± 2) °C przez (18 ± 2) h.

3. Przednamnażanie — objętości > 10 ml

   Przefiltruj próbkę przez jałowy filtr membranowy 0,45 µm (dla wód mętnych: ok. 15 ml środka filtracyjnego na podkładce i 15 ml zmieszane z próbką), zanurz filtr w 50 ml BPW (końcowo 100 ml BPW) i inkubuj w (36 ± 2) °C przez (18 ± 2) h; dla NPL rozdziel do serii probówek.

4. Namnażanie selektywne

   Przenieś 0,1 ml hodowli do 10 ml bulionu RVS i inkubuj w (41,5 ± 1,0) °C przez (24 ± 3) h (nie przekraczaj 42,5 °C; w razie potrzeby przedłuż do łącznie (48 ± 4) h). Równolegle 1 ml do 10 ml MKTTn, (36 ± 2) °C, (24 ± 3) h.

5. Posiew na podłoża stałe

   Z każdej hodowli selektywnej posiej agar XLD i drugie podłoże selektywne; XLD inkubuj dnem do góry w (36 ± 2) °C i oglądaj po (24 ± 3) h, drugie podłoże — wg zaleceń producenta. Zaznacz kolonie przypuszczalne Salmonella.

6. Potwierdzenie

   Kolonie przypuszczalne przesiej (powtórz posiew jak w kroku 5; po (24 ± 3) h w (36 ± 2) °C) i potwierdź testami biochemicznymi oraz serologicznymi (antygeny O, Vi).

7. Wynik

   Podaj obecność Salmonella spp. (przypuszczalnych lub potwierdzonych) lub ich brak w badanej objętości wody; przy serii NPL — liczbę NPL.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Salmonella spp. to patogeny jelitowe (w tym S. Typhi) — praca w warunkach laboratorium mikrobiologicznego, dezynfekcja i autoklawowanie wszystkich hodowli
• Bulion RVS w 41,5 °C i podłoża po autoklawowaniu — ryzyko poparzenia
• Filtracja dużych objętości pod próżnią — sprawny sprzęt szklany, aseptyka przy przenoszeniu filtra

Najczęstsze pytania