🦠 Przypuszczalne Pseudomonas spp. w mięsie i przetworach mięsnych — posiew powierzchniowy na agarze CFC (25 °C, 44 h)

Mikrobiologia PN-EN ISO 13720

Przegląd

ISO 13720:2010 określa metodę oznaczania liczby przypuszczalnych Pseudomonas spp. obecnych w mięsie i przetworach mięsnych, w tym drobiowych. Przypuszczalne Pseudomonas spp. to wg normy bakterie, które w 25 °C tworzą kolonie na agarze z cefalotyną, fusydanem sodu i cetrymidem (CFC) i dają dodatni test oksydazowy. W Polsce obowiązuje jako PN-EN ISO 13720:2010 (zastąpiła PN-ISO 13720:1999).

Podłoże CFC jest dostępne handlowo jako baza (Pseudomonas Agar Base) z suplementem CFC; producent podłoża opisuje je jako selektywne podłoże do wykrywania i oznaczania liczby Pseudomonas spp. zgodne z ISO 13720 (mięso i przetwory mięsne), z odmiennymi suplementami do mleka (ISO/TS 11059, suplement PP) i wody (ISO 16266, suplement CN). Skład typowy bazy: pepton żelatynowy 16,0 g/l, hydrolizat kazeiny 10,0 g/l, siarczan potasu bezwodny 10,0 g/l, chlorek magnezu bezwodny 1,4 g/l, agar 15,0 g/l, pH 7,1 ± 0,2; siarczan potasu i chlorek magnezu sprzyjają wytwarzaniu piocyjaniny, a glicerol jest źródłem węgla i energii. Suplement CFC zawiera cetrymid, kwas fusydowy i cefalorydynę; wszystkie kolonie wyrosłe na CFC uznaje się za podejrzane Pseudomonas spp., a potwierdza się kolonie oksydazo-dodatnie i niefermentujące glukozy.

Zasada metody

Z próbki sporządza się zawiesinę wyjściową i rozcieńczenia dziesiętne. Stałe podłoże selektywne — agar CFC — inokuluje się określoną ilością zawiesiny wyjściowej, a kolejne płytki przygotowuje z rozcieńczeń dziesiętnych; zgodnie z ISO 7218 stosuje się jedną płytkę na rozcieńczenie z co najmniej dwoma kolejnymi rozcieńczeniami. Pipetą przenosi się 0,1 ml zawiesiny wyjściowej na płytkę CFC i 0,1 ml pierwszego rozcieńczenia dziesiętnego na kolejną (nową jałową pipetą), po czym rozprowadza ciecz jałową głaszczką po całej powierzchni agaru. Płytki inkubuje się w 25 °C ± 1 °C przez 44 h ± 4 h. Kolonie przypuszczalnych Pseudomonas spp. potwierdza się testem oksydazowym (dodatni), a liczbę na mililitr lub gram oblicza z liczby potwierdzonych kolonii na płytkę. Podłoże kompletne sporządza się z podłoża podstawowego (pH po sterylizacji 7,2 ± 0,2 w 25 °C; sterylizacja 15 min w 121 °C), do którego po schłodzeniu w łaźni do 47 °C ± 2 °C dodaje się roztwory inhibitorów: na 100 ml podłoża 5 ml roztworu cefalotyny (końcowo 50 µg/ml), 1 ml roztworu fusydanu sodu (10 µg/ml) i 1 ml roztworu cetrymidu (10 µg/ml); roztworów inhibitorów nie przechowuje się dłużej niż 7 dni w 5 °C ± 3 °C. Do jałowych płytek wlewa się ok. 15 ml podłoża kompletnego; nieosuszone płytki można przechowywać do 4 tygodni w 5 °C ± 3 °C.

Zastosowania

• Mięso i przetwory mięsne, w tym drobiowe — oznaczanie liczby przypuszczalnych Pseudomonas spp. (zakres normy)
• Podłoże CFC wg producenta: izolacja Pseudomonas spp. z mięsa i przetworów, produktów mlecznych, wody i próbek środowiskowych
• Laboratoria zakładowe i urzędowe badające surowiec mięsny — podłoże handlowe (baza + suplement CFC)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 13720:2010 (ISO 13720:2010)

Tytuł (PL)

Mięso i przetwory mięsne — Oznaczanie liczby przypuszczalnych Pseudomonas sp.

Title (EN)

Meat and meat products — Enumeration of presumptive Pseudomonas spp.

Procedura krok po kroku

1. Przygotowanie agaru CFC

   Sporządź podłoże podstawowe (pH 7,2 ± 0,2 po sterylizacji), wysterylizuj 15 min w 121 °C, schłodź w łaźni do 47 °C ± 2 °C i na każde 100 ml dodaj 5 ml roztworu cefalotyny, 1 ml roztworu fusydanu sodu i 1 ml roztworu cetrymidu (roztwory ≤ 7 dni w 5 °C ± 3 °C); wymieszaj ostrożnie i wlej ok. 15 ml do jałowych płytek (nieosuszone płytki ≤ 4 tygodnie w 5 °C ± 3 °C).

2. Zawiesina wyjściowa i rozcieńczenia

   Z próbki mięsa przygotuj zawiesinę wyjściową i rozcieńczenia dziesiętne.

3. Posiew powierzchniowy

   Pipetą przenieś 0,1 ml zawiesiny wyjściowej na płytkę CFC; nową jałową pipetą 0,1 ml pierwszego rozcieńczenia dziesiętnego na kolejną płytkę (jedna płytka na rozcieńczenie, co najmniej dwa kolejne rozcieńczenia). Rozprowadź ciecz jałową głaszczką po całej powierzchni agaru.

4. Inkubacja

   Inkubuj płytki w 25 °C ± 1 °C przez 44 h ± 4 h.

5. Potwierdzenie

   Kolonie przypuszczalnych Pseudomonas spp. potwierdź testem oksydazowym (dodatni).

6. Obliczenie i wynik

   Z liczby potwierdzonych kolonii na płytkę oblicz liczbę przypuszczalnych Pseudomonas spp. na gram lub mililitr próbki.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Mięso surowe może zawierać patogeny (Salmonella, Campylobacter) — praca aseptyczna, dezynfekcja, autoklawowanie hodowli
• Antybiotyki (cefalotyna, kwas fusydowy) i cetrymid — unikać wdychania proszków i kontaktu ze skórą, rękawice
• Podłoże w 47 °C i po autoklawowaniu — ryzyko poparzenia

Najczęstsze pytania