🧫 Pseudomonas aeruginosa w wodzie
Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Pseudomonas aeruginosa w wodzie metodą filtracji membranowej na podłożu CN (cetrimide-nalidixic acid). Kluczowy patogen wody butelkowanej i basenowej.
Przegląd
Pseudomonas aeruginosa jest Gram-ujemną, tlenową pałeczką, jednym z najważniejszych patogenów oportunistycznych środowiska wodnego. Bakteria ta potrafi namnażać się w wodzie o bardzo niskiej zawartości substancji odżywczych, tworzy biofilmy na powierzchniach instalacji wodnych, jest odporna na wiele środków dezynfekcyjnych i antybiotyków. Może powodować zakażenia ran, ucha zewnętrznego (zapalenie ucha pływaków), układu moczowego oraz poważne zakażenia szpitalne u pacjentów immunosupresyjnych.
P. aeruginosa nie jest typowym wskaźnikiem zanieczyszczenia kałowego — bakteria pochodzi głównie ze środowiska (gleba, roślinność, biofilmy w instalacjach). Jej obecność w wodzie butelkowanej lub basenowej wskazuje na problemy higieniczne w procesie produkcji, magazynowania lub dystrybucji. Jest parametrem obligatoryjnym dla wody butelkowanej, wody w basenach kąpielowych i wody w obiektach opieki zdrowotnej.
Metoda według PN-EN ISO 16266 wykorzystuje filtrację membranową i hodowlę na podłożu selektywnym z cetrimidem (bromek cetylotrimetyloamoniowy — kationowy detergent hamujący wzrost większości bakterii poza Pseudomonas) i kwasem nalidyksowym (inhibitor bakterii Gram-ujemnych wrażliwych na chinolony). Kolonie P. aeruginosa produkują charakterystyczne pigmenty: piocyjaninę (niebieskozielony) lub fluoresceinę (żółtozielony fluorescencyjny).
Potwierdzenie obejmuje test produkcji amoniaku z acetamidu (odczynnik Nesslera) — pozytywny dla P. aeruginosa — oraz opcjonalnie wzrost w 42°C i test oksydazowy.
Zasada metody
Próbkę wody filtruje się przez membranę 0,45 µm i umieszcza na podłożu CN (Pseudomonas CN agar) zawierającym cetrimid (0,2 g/L) i kwas nalidyksowy (15 mg/L). Inkubacja w 36±2°C przez 40–48 h. Cetrimid hamuje większość bakterii poza Pseudomonas spp. — działa jako kationowy detergent uszkadzający błony komórkowe. P. aeruginosa produkuje rozpuszczalne pigmenty: piocyjaninę (niebiesko-zielona, widoczna w świetle dziennym) i/lub fluoresceinę (żółto-zielona, fluoryzująca w UV 365 nm). Kolonie produkujące piocyjaninę nie wymagają potwierdzenia. Kolonie fluorescencyjne lub brązowo-czerwone wymagają testu acetamidowego.
Zastosowania
- Badanie wody butelkowanej i źródlanej (parametr obligatoryjny)
- Monitoring wody w basenach kąpielowych i aquaparkach
- Kontrola wody w szpitalach i obiektach opieki zdrowotnej
- Badanie wody pitnej w budynkach użyteczności publicznej
- Ocena jakości wody w instalacjach chłodniczych (wieże chłodnicze)
- Kontrola biofilmów w systemach dystrybucji wody
- Badanie wody do dializ i celów farmaceutycznych
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Wynik | jtk/250 mL (woda butelkowana) lub jtk/100 mL |
| Dopuszczalna wartość | 0 jtk/250 mL (woda butelkowana) |
| Temperatura inkubacji | 36 ± 2°C |
| Czas inkubacji | 40–48 godzin |
| Lampa UV | 365 nm do obserwacji fluorescencji |
| Objętość próbki | 250 mL (woda butelkowana), 100 mL (inne) |
Norma
- Numer normy
- PN-EN ISO 16266:2009
- Tytuł (PL)
- Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Pseudomonas aeruginosa — Metoda filtracji membranowej
- Title (EN)
- Water quality — Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa — Method by membrane filtration
Procedura krok po kroku
1. Przygotowanie stanowiska
Wysterylizuj zestaw filtracyjny. Przygotuj płytki Pseudomonas CN Agar (wyjmij z lodówki 30 min wcześniej).
2. Filtracja membranowa
Przefiltruj 250 mL próbki (woda butelkowana) lub 100 mL (inne wody) przez sączek 0,45 µm. Przepłucz lejek sterylną wodą peptonową.
3. Przeniesienie na podłoże
Sterylną pęsetą przenieś sączek na powierzchnię Pseudomonas CN Agar. Unikaj pęcherzyków powietrza.
4. Inkubacja
Inkubuj płytki odwrócone w 36±2°C przez 40–48 godzin. Po 24 h możliwa wstępna ocena.
5. Odczyt — produkcja piocyjaniny
Sprawdź kolonie w świetle dziennym. Kolonie niebiesko-zielone (piocyjanina) = potwierdzone P. aeruginosa bez dalszych testów.
6. Odczyt — fluorescencja UV
Obejrzyj płytki pod lampą UV 365 nm. Kolonie fluoryzujące żółto-zielono ale bez piocyjaniny → wymagają potwierdzenia.
7. Test potwierdzający — acetamid
Przenieś kolonie wymagające potwierdzenia do probówek z podłożem acetamidowym. Inkubuj 36°C/24 h. Dodaj odczynnik Nesslera — żółte zabarwienie = NH₃ = P. aeruginosa (+).
8. Test wzrostu w 42°C (opcjonalnie)
Przenieś kolonie na agar odżywczy i inkubuj w 42°C/24 h. Wzrost potwierdza P. aeruginosa (inne Pseudomonas nie rosną w 42°C).
9. Obliczenie wyniku
Wynik = liczba potwierdzonych kolonii / objętość próbki. Podaj w jtk/250 mL (woda butelkowana) lub jtk/100 mL.
10. Kontrola jakości
Kontrola pozytywna: P. aeruginosa ATCC 27853. Kontrola negatywna: sterylna woda. Kontrola selektywności: E. coli ATCC 25922 (brak wzrostu).
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| System filtracji membranowej | Sartorius Combisart, Merck EZ-Fit | 3 000–12 000 PLN |
| Pompa próżniowa | KNF Laboport N 810 | 3 000–8 000 PLN |
| Inkubator 36°C | Binder BD 56, Memmert IN30 | 5 000–15 000 PLN |
| Lampa UV 365 nm (Wood) | Vilber Lourmat VL-6.L, Analytik Jena UVhand | 500–3 000 PLN |
| Autoklaw | Tuttnauer ELV 2540 | 20 000–45 000 PLN |
| Inkubator 42°C (potwierdzenie) | Binder BD 23 | 5 000–15 000 PLN |
| Komora laminarna | Esco Airstream | 15 000–40 000 PLN |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| Pseudomonas CN Agar | — | Podłoże selektywne z cetrimidem i kwasem nalidyksowym + glicerol. Producenci: Oxoid, Merck, Biokar |
| Cetrimid (bromek cetylotrimetyloamoniowy) | 57-09-0 | Kationowy detergent, selektywny inhibitor, stężenie 0,2 g/L w podłożu |
| Kwas nalidyksowy | 389-08-2 | Inhibitor bakterii Gram-ujemnych wrażliwych, stężenie 15 mg/L w podłożu |
| Odczynnik Nesslera (K₂HgI₄) | 7783-33-7 | Do wykrywania amoniaku z acetamidu — żółte/brązowe zabarwienie = wynik dodatni. UWAGA: zawiera rtęć! |
| Acetamid (CH₃CONH₂) | 60-35-5 | Podłoże do testu potwierdzającego — P. aeruginosa deaminuje acetamid do amoniaku |
| Sączki membranowe 0,45 µm | — | MCE, 47 mm, sterylne. Merck Millipore, Sartorius |
| Tiosiarczan sodu (Na₂S₂O₃) | 7772-98-7 | Neutralizacja chloru w próbkach |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- P. aeruginosa — patogen oportunistyczny, BSL-2. Rękawice, fartuch, okulary ochronne. Pracować w komorze laminarnej
- Odczynnik Nesslera — zawiera rtęć (Hg), silnie toksyczny! Stosować wyłącznie pod wyciągiem, rękawice nitrylowe, utylizacja jako odpad niebezpieczny
- Cetrimid — drażniący dla skóry i oczu. Stosować rękawice ochronne
- Kwas nalidyksowy — unikać kontaktu ze skórą, możliwe reakcje alergiczne
- Materiał zakaźny — autoklaw 121°C/30 min przed utylizacją