🦠 Pseudomonas aeruginosa w wodzie — metoda NPL z podłożem enzymatycznym (Pseudalert / Quanti-Tray)

Mikrobiologia PN-EN ISO 16266-2

Przegląd

ISO 16266-2:2018 określa metodę oznaczania ilościowego Pseudomonas aeruginosa w wodzie opartą na wzroście w podłożu płynnym i obliczeniu najbardziej prawdopodobnej liczby (NPL) z tablic. Stosuje się ją do wielu rodzajów wód: szpitalnych, wody do spożycia, niegazowanych wód butelkowanych, wód podziemnych, basenowych i z wanien spa, w tym o wysokim tle bakterii heterotroficznych. Nie dotyczy wód butelkowanych gazowanych i smakowych, wód z wież chłodniczych ani wód morskich, dla których metoda nie była walidowana — laboratorium może ją tam stosować po własnej walidacji. Wody butelkowane bada się zwykle w objętości 250 ml (wymóg braku P. aeruginosa w 250 ml, np. wg dyrektywy 98/83/WE), pozostałe — 100 ml. Metoda nadaje się też jako procedura jakościowa (obecność/nieobecność).

Test opiera się na technologii wykrywania enzymu bakteryjnego: aktywnie rosnące szczepy P. aeruginosa mają enzym rozszczepiający substrat aminopeptydazowy 7-amido-4-metylokumaryny obecny w podłożu, uwalniając produkt fluoryzujący w UV; bakterie szybko rosną dzięki bogatemu zestawowi aminokwasów, witamin i składników odżywczych. Wynik jest potwierdzony w ciągu 24 h bez potrzeby dalszego potwierdzania dodatnich studzienek. Większość szczepów P. aeruginosa rośnie w 42 °C, a nie w 4 °C, co odróżnia ją od P. fluorescens. Norma odwołuje się do produktów handlowych Pseudalert i Quanti-Tray. W Polsce obowiązuje jako PN-EN ISO 16266-2:2022-04 (wersja polska i angielska). Producent podaje dla Pseudalert te same warunki: inkubacja (38 ± 0,5) °C przez 24–28 h, odczyt fluorescencji w UV, wykrywalność 1 jtk/100 ml.

Zasada metody

Opakowanie (snap pack) odwodnionego podłoża — 2,45 g na 100 ml — dodaje się do próbki wody 100 ml lub 250 ml albo do rozcieńczenia uzupełnionego do 100 ml i delikatnie wstrząsa do rozpuszczenia. Do oznaczenia ilościowego 100 ml próbki z podłożem rozlewa się aseptycznie do tacki Quanti-Tray (do 201 organizmów/100 ml; spodziewane liczby < 200 NPL/100 ml) lub Quanti-Tray/2000 (do 2419 organizmów/100 ml), zgrzewa w zgrzewarce Quanti-Tray i inkubuje w (38 ± 0,5) °C przez 24–28 h; wynik jest potwierdzony po 24 h, ale można go odczytać do 28 h. Dla 250 ml próbkę dzieli się na trzy jałowe przezroczyste naczynia: dwie porcje po 100 ml i jedną 50 ml uzupełnioną 50 ml jałowej, nieinhibitującej wody bez utleniaczy; do każdej dodaje się jedno opakowanie podłoża i rozlewa do trzech tacek, które trzeba jednoznacznie oznakować (tacka z porcją 50 ml liczy się inaczej). Po inkubacji za dodatnie uznaje się naczynia lub studzienki wykazujące jakikolwiek stopień niebieskiej fluorescencji w długofalowym UV (365 nm) w porównaniu z kontrolą ujemną; przy wątpliwości po 24 h inkubację przedłuża się do 28 h. NPL na 100 ml lub 250 ml odczytuje się z tablic statystycznych (B.1, B.2) lub programu; dla 250 ml stosuje się wzór B.2 dla trzech tacek. Studzienki Quanti-Tray mają ok. 1,96 ml, studzienka przelewowa ok. 8,5 ml; w Quanti-Tray/2000 małe ok. 0,16 ml, duże ok. 1,9 ml, przelewowa ok. 11 ml (liczona z dużymi). Podłoże można też rozlać do jałowych probówek w klasycznym układzie NPL (np. 1 × 50 ml i 5 × 10 ml) lub inkubować całą próbkę jako test obecność/nieobecność. Kontrola jakości: wydajność — P. aeruginosa WDCM 00024 (niebieska fluorescencja, PR ≥ 0,5 względem TSA), selektywność — P. fluorescens WDCM 00115 (całkowite zahamowanie, brak fluorescencji).

Zastosowania

• Woda w obiektach szpitalnych i opieki zdrowotnej (P. aeruginosa jako patogen oportunistyczny w instalacjach)
• Woda do spożycia i niegazowane wody butelkowane — wymóg braku P. aeruginosa w 250 ml
• Wody basenowe i z wanien spa, wody podziemne — także o wysokim tle bakterii heterotroficznych
• Test obecność/nieobecność i klasyczny układ probówek NPL z tym samym podłożem
• Laboratoria wodociągów i stacji sanitarno-epidemiologicznych — wynik potwierdzony po 24 h bez posiewów potwierdzających

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 16266-2:2022-04 (ISO 16266-2:2018)

Tytuł (PL)

Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Pseudomonas aeruginosa — Część 2: Metoda najbardziej prawdopodobnej liczby

Title (EN)

Water quality — Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa — Part 2: Most probable number method

Procedura krok po kroku

1. Pobór i transport

   Pobierz próbkę wg zasad ISO 19458; rozpocznij badanie w dniu poboru lub w ciągu 12 h; wyjątkowo przechowuj w (5 ± 3) °C do 24 h i odnotuj czas przechowywania w sprawozdaniu.

2. Dodanie podłoża — 100 ml

   Do 100 ml próbki (lub rozcieńczenia uzupełnionego do 100 ml) w jałowym, przezroczystym naczyniu dodaj aseptycznie jedno opakowanie podłoża Pseudalert i mieszaj do całkowitego rozpuszczenia.

3. Dodanie podłoża — 250 ml

   Podziel próbkę na trzy naczynia: 100 ml, 100 ml i 50 ml; porcję 50 ml uzupełnij 50 ml jałowej, nieinhibitującej wody bez utleniaczy. Do każdej porcji dodaj jedno opakowanie podłoża i wymieszaj; oznakuj tacki (która zawiera porcję 50 ml).

4. Rozlanie i zgrzanie

   Wlej każdą porcję z podłożem do tacki Quanti-Tray (spodziewane < 200 NPL/100 ml) lub Quanti-Tray/2000 i zgrzej. Alternatywnie rozlej do jałowych probówek w układzie NPL (np. 1 × 50 ml i 5 × 10 ml) lub inkubuj całość jako test obecność/nieobecność.

5. Inkubacja

   Inkubuj tacki lub naczynia 24–28 h w (38 ± 0,5) °C.

6. Odczyt

   Obejrzyj w UV 365 nm w porównaniu z kontrolą ujemną: każda studzienka z jakimkolwiek stopniem niebieskiej fluorescencji jest dodatnia dla P. aeruginosa. Przy wątpliwej fluorescencji po 24 h przedłuż inkubację do 28 h; wkładka gumowa ułatwia odczyt.

7. Obliczenie i sprawozdanie

   Z liczby dodatnich studzienek odczytaj NPL/100 ml z tablic B.1/B.2 lub programu; dla 250 ml oblicz NPL z trzech tacek wg wzoru B.2. W sprawozdaniu podaj metodę, identyfikację próbki, wynik i ewentualne przechowywanie w (5 ± 3) °C do 24 h.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• P. aeruginosa jest patogenem oportunistycznym — praca w warunkach laboratorium mikrobiologicznego, autoklawowanie zużytych tacek
• Lampa UV 365 nm — ochrona oczu i skóry podczas odczytu
• Zgrzewarka nagrzewa się — nie dotykać elementów grzejnych

Najczęstsze pytania