🦠 Pseudomonas aeruginosa w kosmetykach — wykrywanie po namnażaniu w bulionie Eugon LT 100 i izolacji na agarze cetrymidowym

Mikrobiologia PN-EN ISO 22717

Przegląd

ISO 22717:2015 podaje ogólne wytyczne wykrywania i identyfikacji Pseudomonas aeruginosa — mikroorganizmu „specyfikowanego” w produktach kosmetycznych; lista mikroorganizmów specyfikowanych może się różnić między krajami zależnie od praktyki i przepisów. Metoda opiera się na wykrywaniu P. aeruginosa w nieselektywnym podłożu płynnym (bulionie namnażającym), a następnie izolacji na selektywnym podłożu agarowym; zależnie od wymaganego poziomu wykrywania właściwe mogą być inne metody (np. przesiewy na podłoża nieselektywne i identyfikacja zestawami). Dla produktów niemieszających się z wodą właściwa może być ISO 18415; metody alternatywne (np. automatyczne) dopuszcza się po wykazaniu równoważności. Norma zaleca analizę ryzyka mikrobiologicznego; produkty niskiego ryzyka (ISO 29621) to m.in. te o niskiej aktywności wodnej, hydroalkoholowe i o skrajnym pH. Główne cechy identyfikacyjne P. aeruginosa wg normy to m.in. wzrost na selektywnym agarze cetrymidowym.

W Polsce obowiązuje jako PN-EN ISO 22717:2016-01 ze zmianą A1:2023-03 (zastąpiła PN-EN ISO 22717:2010). W laboratoriach badających czystość mikrobiologiczną kosmetyków do obserwacji obecności P. aeruginosa wykorzystuje się podłoże selektywne cetrymidowe (Cetrimide Agar) — zgodnie z zestawem norm PN-EN ISO stosowanych do badań ilościowych i jakościowych kosmetyków.

Zasada metody

Pierwszy etap to namnażanie w nieselektywnym bulionie, które zwiększa liczbę mikroorganizmów bez ryzyka zahamowania przez składniki selektywne podłoży selektywno-różnicujących; drugi etap (izolacja) prowadzi się na podłożu selektywnym, po czym wykonuje się testy identyfikacyjne. Ewentualne hamowanie wzrostu drobnoustrojów przez próbkę musi zostać zneutralizowane, a neutralizacja właściwości przeciwbakteryjnych produktu — sprawdzona i wykazana (rozdz. 11 normy, test przydatności na agarze sojowo-kazeinowym). Próbka to co najmniej 1 g lub 1 ml produktu do zawiesiny wyjściowej. Podłoża wg normy: roztwór tryptonu z chlorkiem sodu jako rozcieńczalnik zawiesiny bakteryjnej, agar sojowo-kazeinowy do testu przydatności, bulion Eugon LT 100 do namnażania (dopuszczalne inne buliony), agar cetrymidowy do izolacji P. aeruginosa (zawiera m.in. cetrymid, czyli bromek cetylotrimetyloamoniowy, 0,3 g i glicerol 10,0 ml na 1000 ml; po rozpuszczeniu gotuje się 1 min i sterylizuje w 121 °C przez 15 min) oraz agar Pseudomonas P do wykrywania piocyjaniny (z glicerolem 10,0 ml/l; gotowanie 1 min, sterylizacja 121 °C, 15 min) do potwierdzania.

Zastosowania

• Kontrola czystości mikrobiologicznej kosmetyków — wykrywanie P. aeruginosa jako mikroorganizmu specyfikowanego
• Produkty na bazie wody o wysokim ryzyku (kremy, żele, balsamy, produkty do oczu) — zwalnianie serii
• Badania surowców, wody technologicznej i produktów w trakcie prac nad zakonserwowaniem
• Laboratoria kontraktowe i zakładowe branży kosmetycznej (zestaw PN-EN ISO 21149/16212/21150/22717/22718/18416)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 22717:2016-01 + A1:2023-03 (ISO 22717:2015 + Amd 1:2022)

Tytuł (PL)

Kosmetyki — Mikrobiologia — Wykrywanie obecności Pseudomonas aeruginosa

Title (EN)

Cosmetics — Microbiology — Detection of Pseudomonas aeruginosa

Procedura krok po kroku

1. Analiza ryzyka i próbka

   Ustal, czy produkt podlega badaniu (ISO 29621). Pobierz co najmniej 1 g lub 1 ml produktu i sporządź zawiesinę wyjściową w bulionie namnażającym.

2. Test przydatności

   Wykaż neutralizację właściwości przeciwbakteryjnych produktu (rozdz. 11) z użyciem zawiesiny szczepu odniesienia w roztworze tryptonu z NaCl i agaru sojowo-kazeinowego.

3. Namnażanie

   Inkubuj zawiesinę wyjściową w nieselektywnym bulionie Eugon LT 100 w warunkach podanych w normie.

4. Izolacja

   Posiej z hodowli agar cetrymidowy i inkubuj; oceń wzrost kolonii charakterystycznych dla P. aeruginosa.

5. Potwierdzenie i identyfikacja

   Kolonie podejrzane przesiej na agar Pseudomonas P (wytwarzanie piocyjaniny) i wykonaj testy identyfikacyjne.

6. Wynik

   Podaj obecność lub brak P. aeruginosa w badanej próbce produktu (1 g lub 1 ml), z informacją o wykazanej neutralizacji.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• P. aeruginosa jest patogenem oportunistycznym (zakażenia oczu, ran) — praca w warunkach laboratorium mikrobiologicznego, autoklawowanie hodowli
• Cetrymid (czwartorzędowa sól amoniowa) — drażniący; rękawice i okulary przy ważeniu
• Gorące podłoża po gotowaniu i autoklawowaniu — ryzyko poparzenia

Najczęstsze pytania