🦠 Przypuszczalne Escherichia coli w żywności — NPL (bulion laurylowy 37 °C → bulion EC 44 °C → indol)

Mikrobiologia PN-ISO 7251

Przegląd

ISO 7251:2005 podaje ogólne wytyczne wykrywania obecności i oznaczania liczby przypuszczalnych Escherichia coli techniką hodowli w podłożu płynnym i obliczenia najbardziej prawdopodobnej liczby (NPL) po inkubacji w 37 °C, a następnie w 44 °C; stosuje się ją do produktów dla ludzi i zwierząt oraz próbek środowiskowych z produkcji i obrotu żywnością. Uwaga: niektóre chorobotwórcze szczepy E. coli nie rosną w 44 °C. Ograniczeniem jest duża zmienność metody (rozdz. 10). Trzecie wydanie zastąpiło ISO 7251:1993 oraz ISO 11866-1:1997 i IDF 170-1:1999; główne zmiany: temperatura drugiej inkubacji 44 °C ± 1 °C, objęcie wykrywania i oznaczania, dopuszczenie pięciu probówek na rozcieńczenie dla niektórych produktów, uwaga o produktach mlecznych utrudniających zbieranie gazu, obliczanie NPL wg ISO 7218. Przypuszczalne E. coli definiuje się jako bakterie, które w 44 °C fermentują laktozę z wytworzeniem gazu i w 44 °C wytwarzają indol z tryptofanu. W polskich laboratoriach żywności metoda ta (PN-ISO 7251:2006) stosowana jest obok metod płytkowych ISO 16649 do oznaczania E. coli w produktach, gdzie spodziewane są małe liczby; skrypty UWM opisują analogiczne oznaczanie NPL Enterobacteriaceae i coli w układzie 3-probówkowym.

Zasada metody

Wykrywanie: płynny selektywny bulion namnażający inokuluje się określoną ilością zawiesiny wyjściowej i inkubuje w 37 °C do 48 h, sprawdzając gaz po 24 h i 48 h; przy zmętnieniu lub gazie przesiewa się do bulionu EC i inkubuje w 44 °C do 48 h; probówki z gazem przesiewa się do wody peptonowej bez indolu i inkubuje 48 h w 44 °C, po czym bada wytwarzanie indolu z tryptofanu; probówki z gazem w EC i indolem uznaje się za zawierające przypuszczalne E. coli (wynik „obecne/nieobecne w x g lub x ml”). Oznaczanie: trzy probówki podwójnie stężonego i trzy pojedynczo stężonego bulionu inokuluje się określoną ilością zawiesiny wyjściowej, kolejne trójki — rozcieńczeniami dziesiętnymi; postępowanie jak wyżej, a NPL odczytuje się z tablicy (załącznik A) według liczby probówek, których przesiewy dały gaz w EC i indol w 44 °C. Bulion laurylosiarczanowy: hydrolizat tkanek roślinnych i zwierzęcych 20 g (40 g podwójnie stężony), laktoza 5 g (10 g), K₂HPO₄ 2,75 g (5,5 g), KH₂PO₄ 2,75 g (5,5 g), NaCl 5 g (10 g), laurylosiarczan sodu 0,1 g (0,2 g)/l; pH 6,8 ± 0,2; 9 ml w probówkach 16 × 160 mm z rurką Durhama (pojedynczo) i 10 ml w 18 × 180 lub 20 × 200 mm z rurką (podwójnie); 121 °C 15 min. Bulion EC: hydrolizat kazeiny 20 g, laktoza 5 g, sole żółciowe nr 3 1,5 g, K₂HPO₄ 4 g, KH₂PO₄ 1,5 g, NaCl 5 g/l; pH 6,8 ± 0,2; 10 ml z rurką Durhama. Woda peptonowa bez indolu: hydrolizat kazeiny 10 g, NaCl 5 g/l; pH 7,3 ± 0,2; 5–10 ml. Odczynnik Kovacsa: 4-dimetyloaminobenzaldehyd 5 g, 2-metylobutan-1-ol lub pentan-1-ol 75 ml, HCl (ρ 1,18–1,19) 25 ml; rozpuszczanie w łaźni 50–55 °C, przechowywanie ok. 4 °C bez światła; barwa jasnożółta do jasnobrązowej.

Zastosowania

• Wykrywanie i oznaczanie małych liczb E. coli w żywności (mięso, przetwory mleczne, wyroby garmażeryjne, żywność gotowa)
• Próbki środowiskowe z obszarów produkcji i obrotu żywnością
• Pasze i surowce
• Produkty mleczne — z uwagą, że mogą utrudniać zbieranie gazu w rurce Durhama (dopuszczalne 5 probówek na rozcieńczenie)
• Uzupełnienie metod płytkowych (ISO 16649) przy oczekiwanym poziomie poniżej ich granicy oznaczalności

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-ISO 7251:2006 (ISO 7251:2005)

Tytuł (PL)

Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda wykrywania obecności i oznaczania liczby przypuszczalnych Escherichia coli — Metoda najbardziej prawdopodobnej liczby

Title (EN)

Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection and enumeration of presumptive Escherichia coli — Most probable number technique

Procedura krok po kroku

1. Próbka

   Przygotuj próbkę, zawiesinę wyjściową i rozcieńczenia dziesiętne wg ISO 6887-1 do -4 (mleko: ISO 8261) lub normy dla produktu.

2. Inokulacja bulionu laurylosiarczanowego

   Wykrywanie: określoną ilość zawiesiny wyjściowej do probówki bulionu. Oznaczanie: po trzy probówki bulionu podwójnie i pojedynczo stężonego określoną ilością zawiesiny oraz po trzy probówki pojedynczo stężonego kolejnymi rozcieńczeniami dziesiętnymi.

3. Inkubacja w 37 °C

   Inkubuj do 48 h w 37 °C; sprawdź wytwarzanie gazu po 24 h i 48 h (przy produktach mlecznych zbieranie gazu może być utrudnione).

4. Przesiew do bulionu EC

   Z każdej probówki podwójnie stężonej ze zmętnieniem lub gazem oraz każdej pojedynczo stężonej z gazem przesiej ezą do bulionu EC; inkubuj w 44 °C do 48 h, sprawdzając gaz po 24 h i 48 h.

5. Test indolowy

   Z probówek EC z gazem przesiej do wody peptonowej bez indolu, inkubuj 48 h w 44 °C i dodaj odczynnik Kovacsa — wytworzenie indolu (barwa) świadczy o przypuszczalnych E. coli.

6. Wynik

   Wykrywanie: obecność/nieobecność przypuszczalnych E. coli w x g lub x ml. Oznaczanie: z liczby probówek pojedynczo i podwójnie stężonych, których przesiewy dały gaz w EC i indol, odczytaj NPL z tablicy załącznika A (obliczanie wg ISO 7218); w sprawozdaniu uwzględnij zmienność metody i odstępstwa.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Hodowle E. coli mogą obejmować szczepy chorobotwórcze — praca w laboratorium mikrobiologicznym, autoklawowanie odpadów
• Odczynnik Kovacsa zawiera stężony HCl i alkohole amylowe — praca pod wyciągiem, ochrona oczu i rąk
• Inkubacja w 44 °C — kontrola temperatury łaźni; probówki z gazem otwierać ostrożnie

Najczęstsze pytania