🍎 Przygotowanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME) z olejów i tłuszczów — cztery metody: szybka transmetylacja KOH w metanolu (5.2), ogólna zasadowo-kwaśna (5.3), BF3 (5.4) i transmetylacja katalizowana kwasem (5.5), PN-EN ISO 12966-2

Chemia żywności PN-EN ISO 12966-2

Przegląd

CO TA NORMA OPISUJE. Mamy fragment próbny ISO 12966-2:2017 (wydanie drugie) — od spisu treści do początku punktu 5.2.5 (strona 3 z 15); tekst wprowadza PN-EN ISO 12966-2:2017-05 bez zmian (IDT). Zakres (rozdz. 1): metody przygotowania estrów metylowych kwasów tłuszczowych z olejów i tłuszczów zwierzęcych i roślinnych, kwasów tłuszczowych i mydeł — cztery metody metylacji: (a) „szybka" transmetylacja w warunkach zasadowych, (b) „ogólna" transmetylacja/metylacja w warunkach kolejno zasadowych i kwaśnych, (c) transmetylacja z BF3, (d) alternatywna transmetylacja glicerydów katalizowana kwasem. Estry służą do chromatografii gazowej (GLC), cienkowarstwowej (TLC) i spektrometrii w podczerwieni (IR). Mleko i przetwory mleczne (i tłuszcz z nich pochodzący) są WYŁĄCZONE z zakresu — to jedyna zmiana wobec wydania 2011 według przedmowy.

DLACZEGO ESTRY I KTÓRĄ METODĘ WYBRAĆ (wprowadzenie i rozdz. 4). Triacyloglicerole są zbyt mało lotne, a wolne kwasy tłuszczowe źle się chromatografują, dlatego przed GC tworzy się estry metylowe; niepełna konwersja, zmiana struktury kwasów (izomerów pozycyjnych i geometrycznych) i artefakty niebędące FAME zmieniają wynik składu. Transmetylacja jest odwracalna — wymaga dużego nadmiaru metanolu, a woda utrudnia jej zakończenie; procedury zasadowe nie tworzą FAME z wolnych kwasów (powstają mydła). Metoda szybka (5.2) nadaje się do rutynowej analizy olejów i tłuszczów jadalnych z kwasami od masłowego (C4:0) oraz do oznaczania kwasu masłowego i kapronowego ze wzorcem wewnętrznym, ale nie estryfikuje wolnych kwasów; norma sugeruje ją tylko przy zawartości wolnych kwasów tłuszczowych ≤ 0,5 % (m/m), a metodę ogólną (5.3) — powyżej 0,5 %; tłuszcz częściowo zhydrolizowany można przeprowadzić w FAME procedurą 5.5. Metoda ogólna działa dla wszystkich olejów i tłuszczów, także destylatów i olejów kwasowych, ale nie jest zalecana dla olejów laurynowych — krótkołańcuchowe estry giną podczas ogrzewania pod chłodnicą zwrotną. BF3 — z powodu toksyczności tylko „w ostateczności", nie dla tłuszczów mlecznych; wysokie stężenia BF3 (50 %) dają artefakty metoksylowe z kwasów nienasyconych, odczynnik ma ograniczoną trwałość (przechowywać w chłodni), a każdą nową partię sprawdza się przed użyciem. Grupy ketonowe, epoksydowe, hydroksylowe i wodoronadtlenkowe, pierścienie cyklopropylowe i cyklopropenylowe oraz kwasy acetylenowe mogą się rozkładać podczas metylacji. Przy BF3 izooktan daje najlepszy odzysk estrów, ale kapronianu metylu odzyskuje się tylko ok. 75 %. Krótkołańcuchowe estry giną przez lotność (ogrzewanie pod chłodnicą zwrotną), rozpuszczalność w wodzie (ekstrakcja wodna) i przy odparowaniu rozpuszczalnika; załącznik A daje prosty test TLC kompletności derywatyzacji.

METODA SZYBKA — CO JEST W FRAGMENCIE (5.2). Zasada: estry tworzy transmetylacja metanolowym roztworem wodorotlenku potasu; wolne kwasy nie ulegają estryfikacji. Odczynniki: metanol z najwyżej 0,5 % wody, woda klasy 3 według ISO 3696, bezwodny wodorosiarczan sodu, izooktan (2,2,4-trimetylopentan) o czystości chromatograficznej, metanolowy KOH ok. 2 mol/l (13,1 g KOH o zawartości 85 g/100 g na 100 ml bezwodnego metanolu, rozpuszczanie z lekkim ogrzewaniem), wzorzec wewnętrzny — ester metylowy kwasu walerianowego (pentanian metylu, 250 mg w kolbie 50 ml izooktanu; roztwór odniesienia 10 ml w 100 ml) — tylko do oznaczania kwasu masłowego i kapronowego, i roztwór NaCl (40 g w 100 ml wody). Każdą nową partię odczynnika sprawdza się, przygotowując ester czystego kwasu oleinowego — dodatkowe piki dyskwalifikują odczynnik. Sprzęt: probówki 10 ml z zakrętką z uszczelką PTFE, pipety według ISO 8655-2, fiolki 3 ml, kolby miarowe klasy A według ISO 1042. Uwaga do 5.2.1: podobną procedurę stosuje się według COI/T.20/Doc. No. 24:2001 do oliwy z oliwek (dziewiczej o kwasowości poniżej 3,3 %, rafinowanej, mieszanej) i do oleju z wytłoczyn oliwek. Przebieg zaczyna się od naważki około 0,1 g w probówce 10 ml — dalej fragment się urywa.

STATUS (stan kart na 29.09.2026). Karta PN-EN ISO 12966-2:2017-05 (wersja polska) nie ma nagłówka „Wycofana" — norma jest AKTUALNA: data publikacji wersji polskiej 14-11-2022, 24 strony, grupa cenowa M, Sektor Żywności, Rolnictwa i Leśnictwa, KT 92 Nasion Roślin Oleistych, Tłuszczów Roślinnych i Zwierzęcych oraz ich Produktów Ubocznych, ICS 67.200.10, „Wprowadza: EN ISO 12966-2:2017 [IDT], ISO 12966-2:2017 [IDT]", „Zastępuje: PN-EN ISO 12966-2:2011 - wersja angielska". Karta wersji angielskiej tego samego wydania: publikacja 17-05-2017, 30 stron, grupa cenowa P, to samo pole „Zakres". Karta PN-EN ISO 12966-2:2011 (wersja angielska): „Wycofana i zastąpiona przez PN-EN ISO 12966-2:2017-05", publikacja 31-03-2011, „Data wycofania: 17-05-2017", 17 stron, „Zastępuje: PN-EN ISO 5509:2001 - wersja polska". ISO 12966-2:2017 przejrzano i potwierdzono w 2022 r. (strona normy w ISO).

ILE LABORATORIÓW I W JAKIEJ POSTACI (kopia bazy zakresów akredytacji, wsad do 17.09.2026, odczyt 29.09.2026). Wszystkie zapisy numeru 12966-2: 19 pozycji u 11 laboratoriów. „PN-EN ISO 12966-2:2017-05" — 10 laboratoriów, „PN-EN ISO 12966-2" bez roku — AB 444. Wiele laboratoriów zawęża normę do jednej lub dwóch metod (dopiski stoją przy numerze normy i w dokumentach PCA, i w bazie serwisu): tylko metoda szybka 5.2 — AB 539 („z wyłączeniem punktu 5.3; 5.4; 5.5") i AB 1179 („pkt 5.2"); tylko metoda ogólna 5.3 — AB 819 („pkt. 5.3"); 5.2 i 5.3 — AB 565 („p.5.2, p. 5.3") i AB 1679 („z wyłączeniem punktu 5.4 i 5.5"); tylko BF3 (5.4) — AB 562 („z wyłączeniem pkt. 5.2, 5.3 i 5.5", trzy pozycje); całą normę — AB 343, AB 444, AB 515, AB 552 i AB 775. Zakładka „Laboratoria" szuka zapisów ZACZYNAJĄCYCH SIĘ od „PN-EN ISO 12966-2" i pokaże wszystkie 11 laboratoriów — sprawdzone zapytaniem zakładki na serwerze produkcyjnym labcoda.pl 29.09.2026: 11. Aktualne zakresy na stronach PCA (odczyt 29.09.2026, wydania od 03.11.2025 do 18.09.2026): wszystkie pozycje stoją w obowiązujących wydaniach, każda para liczb zakresu z kopii występuje w aktualnym dokumencie i żadna pozycja nie jest zawieszona (przypisy o zawieszeniu w zakresie AB 1179 dotyczą innych pozycji).

PRZEDMIOT I WIELKOŚCI. Kwas erukowy — AB 343 (oleje i tłuszcze roślinne, preparaty dla niemowląt, musztarda), AB 539 (oleje), AB 552 (oleje, środki specjalnego przeznaczenia żywieniowego, musztarda), AB 562 (oleje i tłuszcze, preparaty dla niemowląt), AB 565 (tłuszcze jadalne) i AB 775 (nasiona rzepaku) — zakresy od (0,1 – 1,5) % (AB 343, preparaty dla niemowląt) do (10,0 – 55,0) % tłuszczu (AB 552, musztarda); AB 565 podaje zakres tylko w g/kg — (1,0 – 50,0) g/kg. Skład kwasów tłuszczowych (od C4:0 lub C6:0 wzwyż) — AB 444, AB 515, AB 819, AB 1179 i AB 1679 (także biopaliwa ciekłe: olej roślinny), AB 562 — kwasy omega-3 i kwas linolowy. Technika wszędzie: chromatografia gazowa z detekcją płomieniowo-jonizacyjną (GC-FID). Pozycja AB 562 z kwasami omega-3 (metoda BF3) obejmuje w przedmiocie także mleko i produkty mleczne — wydanie 2017 wyłącza je z zakresu normy, a wprowadzenie wyłącza tłuszcze mleczne z metody BF3.

OBOK TEJ NORMY. W tych samych pozycjach: PN-EN ISO 12966-4:2015-07 (oznaczanie techniką kapilarnej chromatografii gazowej) — 9 laboratoriów (AB 343, AB 444, AB 515, AB 552, AB 562, AB 775, AB 819, AB 1179, AB 1679) i PN-EN ISO 12966-1:2015-01 (z poprawką AC:2015-06 lub bez) — 8 (AB 515, AB 539, AB 552, AB 562, AB 775, AB 819, AB 1179, AB 1679); ponadto PN-ISO 1444:2000 — AB 343 (przy olejach, preparatach dla niemowląt i musztardzie), procedury IB-05 wyd. 6 z 12.05.2021 i IB-17 wyd. 4 z 10.03.2021 — AB 1179. PN-EN ISO 12966-1 ma w Bazie Wiedzy osobny wpis. Karta PN-EN ISO 12966-4:2015-07 (wersja polska, stan na 29.09.2026): „Wycofana i zastąpiona przez PN-EN ISO 12966-4:2026-08 - wersja angielska", publikacja wersji polskiej 03-10-2022, „Data wycofania: 31-08-2026", 28 stron, KT 92, w polu „Informacje dodatkowe": „Aktualna w ocenie zgodności: 30-09-2026 - Patrz Komunikat Prezesa PKN"; karta PN-EN ISO 12966-4:2026-08 (wersja angielska): publikacja 31-08-2026, 52 strony, „Wprowadza: EN ISO 12966-4:2026 [IDT], ISO 12966-4:2026 [IDT]", „Zastępuje" obie wersje wydania 2015-07. Osiem z tych laboratoriów ma w zakresie wydanie 2015-07, AB 444 — zapis bez roku. Pole „Zakres" karty wydania 2015-07: metoda oznaczania FAME z transestryfikacji lub estryfikacji tłuszczów, olejów i kwasów tłuszczowych techniką kapilarnej GLC, rozdzielanie estrów metylowych od C8 do C24 — nasyconych oraz cis- i trans-jedno- i wielonienasyconych kwasów tłuszczowych; nie dla tłuszczu z mleka przeżuwaczy i produktów wzbogacanych sprzężonym kwasem linolowym (CLA), mleko i produkty mleczne poza zakresem, nie dla di-, tri-, polimeryzowanych i oksydowanych kwasów tłuszczowych. Pole „Zakres" karty wydania 2026-08: rozdzielanie estrów od C4 do C24 (tak samo: nasyconych oraz cis- i trans-jedno- i wielonienasyconych kwasów tłuszczowych), także tłuszcze wyekstrahowane z produktów żywnościowych; nie dla mleka i produktów mlecznych ani produktów wzbogaconych CLA, nie dla di-, tri-, polimeryzowanych, hydroksylowanych i oksydowanych kwasów tłuszczowych; w załączniku E — skład FAME jako % powierzchni w płynnych olejach roślinnych. Kwas masłowy (C4:0) oznaczają w tych pozycjach AB 444, AB 819 i AB 1179, kapronowy (C6:0) jako pierwszy kwas listy — AB 515 — wszystkie przy części 4 w wydaniu 2015-07 (AB 444 bez roku); w części 2 krótkie łańcuchy obejmuje metoda szybka ze wzorcem wewnętrznym (5.2); z części 2 AB 1179 powołuje tylko 5.2, AB 819 — tylko metodę ogólną 5.3, AB 444 i AB 515 — całą normę. Karta PN-ISO 1444:2000 (wersja polska): bez nagłówka „Wycofana", „Mięso i przetwory mięsne — Oznaczanie zawartości tłuszczu wolnego", ekstrakcja wysuszonej pozostałości n-heksanem lub eterem naftowym, publikacja 14-06-2000, 7 stron, KT 93 Mięsa, Jaj i ich Przetworów, wprowadza ISO 1444:1996 [IDT]. Kwas erukowy bez tej normy oznacza 8 laboratoriów, wyłącznie według procedur własnych (AB 311, AB 313, AB 377, AB 381, AB 438, AB 509, AB 591, AB 1275); wszystkie te wiersze stoją w aktualnych zakresach PCA bez zawieszenia (odczyt 29.09.2026).

GDZIE ŁATWO O WYNIK POZORNIE POPRAWNY. Metoda szybka nie estryfikuje wolnych kwasów tłuszczowych: wynik składu opisuje wtedy kwasy związane w glicerydach, a wolne kwasy w roztworze mogą dać dodatkowe piki i utrudnić identyfikację estrów (rozdz. 4). Norma dopuszcza założenie, że wolne kwasy mają rozkład jak triglicerydy, ale zwykle tylko w olejach surowych — w rafinowanych i frakcjonowanych bywa inaczej. Po drugie, krótkie łańcuchy (C4–C6) giną przy ogrzewaniu, w wodzie i przy odparowaniu rozpuszczalnika — a przy BF3 kapronian metylu odzyskuje się tylko w ok. 75 %. Po trzecie, BF3 z postarzałej partii albo w wysokim stężeniu daje artefakty — dodatkowe piki mogą zostać wzięte za kwasy tłuszczowe.

CZEGO NIE PODAJEMY. Fragment kończy się na początku przebiegu metody szybkiej (5.2.5), dlatego nie podajemy dalszych kroków metody szybkiej, odczynników i przebiegu metod ogólnej (5.3), BF3 (5.4) ani katalizowanej kwasem (5.5), ani testu TLC z załącznika A. Warunków rozdziału chromatograficznego ta część nie podaje — są w PN-EN ISO 12966-4.

Zasada metody

Kwasy tłuszczowe związane w acyloglicerolach przeprowadza się w estry metylowe przez transmetylację w metanolu z katalizatorem zasadowym (KOH — metoda szybka, bez estryfikacji wolnych kwasów), w dwóch etapach: zasadowym i kwaśnym (metoda ogólna, także dla wolnych kwasów), z BF3 (metylacja wolnych kwasów i transmetylacja estrów) albo z katalizatorem kwasowym (tłuszcze częściowo zhydrolizowane). Estry ekstrahuje się izooktanem i poddaje chromatografii gazowej według innej części normy. Wybór metody zależy od zawartości wolnych kwasów (≤ 0,5 % — szybka, > 0,5 % — ogólna), obecności krótkich łańcuchów i grup nietrwałych; BF3 — tylko w ostateczności.

Zastosowania

• Kwas erukowy w olejach, tłuszczach, nasionach rzepaku, musztardzie i preparatach dla niemowląt — 6 laboratoriów
• Skład kwasów tłuszczowych żywności, olejów i biopaliw z oleju roślinnego (od C4:0) — 6 laboratoriów
• Przygotowanie FAME do GC, TLC i IR; bez mleka i przetworów mlecznych (wyłączone z zakresu wydania 2017)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 12966-2:2017-05 (wersja polska z 14-11-2022 i wersja angielska; EN ISO 12966-2:2017, ISO 12966-2:2017 IDT)

Tytuł (PL)

Oleje i tłuszcze roślinne oraz zwierzęce — Chromatografia gazowa estrów metylowych kwasów tłuszczowych — Część 2: Przygotowanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych

Title (EN)

Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of fatty acid methyl esters — Part 2: Preparation of methyl esters of fatty acids

Procedura krok po kroku

1. Wybór metody

   Zawartość wolnych kwasów tłuszczowych ≤ 0,5 % — metoda szybka (5.2); > 0,5 % — ogólna (5.3); tłuszcz częściowo zhydrolizowany — 5.5; BF3 (5.4) tylko w ostateczności; mleko i przetwory mleczne poza zakresem.

2. Kontrola odczynników

   Każdą nową partię odczynnika lub rozpuszczalnika sprawdza się na estrze czystego kwasu oleinowego — nieoczekiwane piki dyskwalifikują odczynnik.

3. Próbka analityczna

   Według ISO 661; tłuszcz stały ogrzewa się tuż powyżej temperatury topnienia (5.1).

4. Metoda szybka — początek

   Około 0,1 g próbki w probówce 10 ml z zakrętką; przy oznaczaniu ze wzorcem wewnętrznym — naważka dokładna; dalsze kroki poza fragmentem — NIE PODAJEMY.

5. Chromatografia

   Estry w izooktanie do GC według innej części normy (PN-EN ISO 12966-4); tej części NIE PODAJEMY.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Metanolowy roztwór wodorotlenku potasu jest trujący i żrący — ochrona oczu i przed oparzeniem chemicznym (ostrzeżenie w rozdz. 5)
• Izooktan jest palny i toksyczny przy połknięciu i wdychaniu, granice wybuchowości 1,1–6,0 % obj.; BF3 — toksyczny, tylko w ostateczności; praca pod sprawnym wyciągiem

Najczęstsze pytania