⚗️ Insektycydy chloroorganiczne (HCH, DDT, aldryna, dieldryna…), PCB i chlorobenzeny w wodzie — ekstrakcja ciecz–ciecz heksanem i GC-ECD

Fizykochemia PN-EN ISO 6468

Przegląd

ISO 6468:1996 opisuje metodę oznaczania wybranych insektycydów chloroorganicznych, polichlorowanych bifenyli (PCB) i chlorobenzenów (bez mono- i dichlorobenzenów) w wodzie do spożycia, podziemnej, powierzchniowej i ściekach; stosuje się ją do próbek zawierających do 0,05 g/l zawiesiny — w obecności materii organicznej, zawiesin i koloidów zakłócenia są liczniejsze, a granice wykrywalności wyższe. Metoda daje informację o konkretnych kongenerach PCB, nie o sumie PCB. Granice wykrywalności (tablica 1) dla wód o niskiej zawartości substancji organicznych: insektycydy chloroorganiczne (α-, β-, γ-, δ-, ε-HCH, o,p'- i p,p'-DDE, -DDD, -DDT, metoksychlor, aldryna, dieldryna, endryna, heptachlor i jego epoksyd, α- i β-endosulfan) 1–10 ng/l zależnie od związku; chlorobenzeny (tri-, tetra-, penta-, heksachlorobenzen, PCNB) 1–10 ng/l; PCB 28, 52, 101, 138, 153, 180, 194 — 1–50 ng/l. Przy bardzo niskich stężeniach kluczowy jest problem zanieczyszczeń — poniżej 10 ng/l wymagana jest szczególna ostrożność. Każda substancja dająca odpowiedź detektora ECD o nierozróżnialnym czasie retencji zakłóca; w praktyce wiele z nich usuwa ekstrakcja i oczyszczanie, a użycie dwóch kolumn kapilarnych o różnej polarności zwykle wystarcza (wyniki traktuje się jako stężenia maksymalne). Rozporządzenie z 2019 r. (Dz.U. 2019 poz. 1311) wskazuje PN-EN ISO 6468 jako metodykę referencyjną GC dla aldryny, dieldryny, endryny, DDT, HCB, HCH, pozostałych insektycydów, trichlorobenzenu i PCB w ściekach (np. wykrywalność 1 µg/l dla DDT, 0,5–1 µg/l dla HCB). W Polsce obowiązuje jako PN-EN ISO 6468:2002 (wersja polska).

W podręczniku PWr „Chemia wody” oznaczanie pestycydów chloroorganicznych opiera się na PN-EN ISO 6468:2002 (ekstrakcja n-heksanem — 1 h dla próbek bez zawiesin, 4 h z zawiesinami; oddestylowanie do ok. 2 cm³, nie do sucha; oczyszczanie na florisilu; GC-ECD z detektorem ⁶³Ni, kolumna Zebron MultiResidue-1, dozownik i kolumna 195 °C, detektor 185 °C, argon 99,9 %; poziomy oznaczalności γ-HCH 0,0005, DDE 0,002, DDD 0,003, DDT 0,005, metoksychlor 0,010 µg/dm³; wynik jako średnia dwóch oznaczeń różniących się ≤ 15 %) oraz alternatywnie na PN-EN 16693 (SPE z krążkami i GC-MS).

Zasada metody

Ekstrakcja ciecz–ciecz insektycydów chloroorganicznych, chlorobenzenów i PCB rozpuszczalnikiem ekstrakcyjnym; po zatężeniu składników o małej lotności i ewentualnym oczyszczeniu ekstrakty analizuje się chromatografią gazową z detektorem wychwytu elektronów. Odczynniki: woda oczyszczona (wymiana jonowa lub węgiel), rozpuszczalnik ekstrakcyjny — heksan, eter naftowy lub heptan (inne przy odzysku ≥ 60 %; „pesticide grade” po sprawdzeniu przez zatężenie 200 ml do 1 ml), bezwodny siarczan sodu (prażony 4 h w 500 ± 20 °C), dekan lub dodekan jako „keeper”, tlenek glinu suchy (500 °C, 4 h) i dezaktywowany (7 % ± 0,2 % wody, 2 h), tlenek glinu/azotan srebra (0,75 g AgNO₃ w 0,75 ml wody + 4,0 ml acetonu + 10 g dezaktywowanego Al₂O₃; w ciemności, użyć w ciągu 4 h), żel krzemionkowy 63–200 µm (500 ± 30 °C ok. 14 h; dezaktywowany 3 % wody, użyć w 24 h), toluen, eter dietylowy bez nadtlenków, granulki wrzenne myte acetonem, wzorce czyste lub certyfikowane (roztwory podstawowe np. 50 mg/100 ml w acetonie, pentanie, heksanie, dimetylobenzenie lub izooktanie; trwałe ok. 1 rok w 4 °C w ciemności), pośrednie (typowo 10 µg/ml; 6 miesięcy) i robocze (≥ 5 stężeń w zakresie ng/ml; 1 miesiąc), rozpuszczalnik mieszający się z wodą (aceton, metanol, DMF) do wzbogacania. Aparatura: GC z ECD i kolumnami kapilarnymi (szkło lub krzemionka, śr. wewn. < 0,4 mm, 25–60 m; dozownik on-column lub ze szklaną wkładką; piec izotermiczny i programowany), rozdzielacze 1–5 l z kranem szklanym mytym heksanem lub PTFE, mieszadło szybkoobrotowe i mieszadełko magnetyczne w PTFE, mikroseparator, aparat Kuderny-Danisha z mikrokolumną Snydera, wyparka obrotowa, kolumna susząca (5–7 g Na₂SO₄, warstwa 7–10 cm, np. 10 × 250 mm), kolumny do oczyszczania (Al₂O₃/AgNO₃ 10 × 250 mm; żel krzemionkowy — makrokolumna 19 × 400 mm lub mikrokolumna), strzykawki mikrolitrowe; szkło myte detergentem, mieszaniną chromową lub nadtlenodisiarczanową, płukane heksanem lub wygrzewane ≥ 12 h w 200 °C (bez szkła kalibrowanego), z losową kontrolą ślepych. Próbki: brązowe butelki szklane 1–5 l ze szlifem lub nakrętką z PTFE (nie z tworzyw), napełnione w 80–90 %; pH 5–7,5 (korekta zaraz po poborze); dla endosulfanu osobna próbka w pH 2; przechowywanie w ciemności w ok. 4 °C, ekstrakcja jak najszybciej (najlepiej w ciągu 24 h); wysuszone ekstrakty można trzymać w 4 °C do dwóch miesięcy, nie odparowywać do sucha. Objętość wody ustala się przez zważenie butelki przed ekstrakcją i po opróżnieniu. Kalibracja: a) bezpośrednie nastrzyki roztworów roboczych (1–10 µl) — liniowość, czasy retencji, względne odpowiedzi; b) kalibracja całej procedury na wzbogaconych próbkach wody (≥ 5 poziomów, np. 1–200 ng/l, z dodatkiem < 1 ml rozpuszczalnika na litr), z której oblicza się odzysk każdego analitu; codzienna rekalibracja; ślepa próba z czystej wody przez całą procedurę — wartość > 10 % najniższego wyniku wymaga wyjaśnienia.

Zastosowania

• Woda do spożycia i wody podziemne — pozostałości insektycydów chloroorganicznych (HCH/lindan, DDT i metabolity, aldryna, dieldryna, endryna, heptachlor) na poziomie ng/l
• Wody powierzchniowe i ścieki — PCB (kongenery 28, 52, 101, 138, 153, 180, 194) i chlorobenzeny (HCB, PeCB, TeCB, TCB); metodyka referencyjna wg Dz.U. 2019 poz. 1311
• Monitoring substancji priorytetowych i trwałych zanieczyszczeń organicznych (POP) w środowisku wodnym
• Próbki o niskiej zawartości zawiesin (≤ 0,05 g/l) — analiza śladowa z kontrolą zanieczyszczeń
• Laboratoria z GC-ECD i dwiema kolumnami kapilarnymi o różnej polarności; alternatywnie GC-MS po SPE (PN-EN 16693)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 6468:2002 (ISO 6468:1996)

Tytuł (PL)

Jakość wody — Oznaczanie wybranych chloroorganicznych insektycydów, polichlorowanych bifenyli i chlorobenzenów — Metoda chromatografii gazowej po ekstrakcji ciecz-ciecz

Title (EN)

Water quality — Determination of certain organochlorine insecticides, polychlorinated biphenyls and chlorobenzenes — Gas chromatographic method after liquid-liquid extraction

Procedura krok po kroku

1. Pobór i przechowywanie

   Pobierz wg ISO 5667-1/-2 do brązowych butelek szklanych 1–5 l (nie z tworzyw), napełniając w 80–90 %; skoryguj pH do 5–7,5 zaraz po poborze (endosulfan — osobna próbka w pH 2); trzymaj w ciemności w ok. 4 °C, z dala od stężonych roztworów; ekstrahuj jak najszybciej (≤ 24 h). Objętość wody ustal przez zważenie butelki przed i po opróżnieniu.

2. Ekstrakcja

   Jeśli butelka jest pełna, odlej 30–100 ml. Wariant A: dodaj 30 ml rozpuszczalnika, wytrząsaj ≥ 10 min, przenieś do rozdzielacza, oddziel fazę wodną z powrotem do butelki i powtórz ekstrakcję dwukrotnie po 20–30 ml. Wariant B: dodaj 20–30 ml rozpuszczalnika, mieszaj mieszadłem magnetycznym ≥ 10 min przy ≥ 1000 obr/min (lub szybkoobrotowym 2 min w 4 °C) pod przykryciem, rozdziel fazy w mikroseparatorze dolewając oczyszczoną wodę i pobierz ekstrakt pipetą.

3. Suszenie

   Przepuść ekstrakt przez kolumnę z bezwodnym Na₂SO₄ przemytą rozpuszczalnikiem (przemyj dodatkowo 10–20 ml) albo dodaj Na₂SO₄ do kolby (wstrząsać 1 min, odstawić 5 min, zdekantować, przemyć 10–20 ml) albo zamroź ekstrakt w −18 °C na 2 h i zdekantuj znad lodu (przemyj 10 ml).

4. Zatężanie

   Kuderna-Danish: z 2 granulkami wrzennymi odparuj na łaźni parowej do 5 ± 1 ml, dalej mikrokolumną Snydera lub łagodnym strumieniem azotu (łaźnia ≤ 40 °C) do < 1 ml (przy < 0,5 ml dodaj keeper). Wyparka obrotowa: do ≥ 0,6 ml przy próżni > 340 mbar, łaźnia ≤ 50 °C; przenieś ilościowo do kolby 1 ml i uzupełnij rozpuszczalnikiem. Nie odparowywać do sucha.

5. GC-ECD i ewentualne oczyszczanie

   Ekstrakty czystych wód analizuj bezpośrednio: nastrzyknij 1–10 µl (jak przy kalibracji) i porównaj chromatogram z wzorcami. Przy nakładających się pikach oczyść: na kolumnie Al₂O₃/AgNO₃ (15 ml rozpuszczalnika, 1,0 g Al₂O₃/AgNO₃, 2,0 g Al₂O₃, 5 mm Na₂SO₄; nanieść ekstrakt, przemyć 2 ml, eluować 30 ± 1 ml; sczerniała cała kolumna — powtórzyć na świeżej) lub na żelu krzemionkowym (1 g w heksanie, 0,2 g Na₂SO₄; 100 µl ekstraktu; frakcje 2,5/2,5/8 ml heksanu, 8 ml heksan/toluen 95:5, 16 ml 90:10, 8 ml heksan/eter 99,5:0,5; ok. 1–2 krople/s, azot ok. 25 mbar); zatęż frakcje i analizuj.

6. Kalibracja, ślepa i wynik

   Kalibruj bezpośrednimi nastrzykami roztworów roboczych (regresja liniowa y = m·ρ + b; przy dużym wyrazie wolnym odrzuć najwyższe stężenia) oraz całą procedurą na wzbogaconych próbkach wody (≥ 5 poziomów, np. 1–200 ng/l; < 1 ml rozpuszczalnika na litr; w dniu użycia) — oblicz odzysk; rekalibruj codziennie. Wykonaj ślepą próbę przez całą procedurę (> 10 % najniższego wyniku → szukaj przyczyny). Potwierdź identyfikację na drugiej kolumnie; wynik podaj jako stężenie maksymalne (możliwa koelucja) w ng/l lub µg/l.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Insektycydy chloroorganiczne i PCB są toksyczne, trwałe i bioakumulujące — rękawice, wyciąg, minimalne ilości wzorców, odpady do utylizacji
• Heksan, eter naftowy, toluen, eter dietylowy — łatwopalne; eter tworzy nadtlenki (stosować wolny od nadtlenków)
• Mieszanina chromowa / nadtlenodisiarczanowa do mycia szkła — silnie żrąca i utleniająca
• Detektor ECD zawiera źródło ⁶³Ni — obsługa zgodnie z przepisami o źródłach promieniotwórczych

Najczęstsze pytania