🦠 Ogólna liczba drobnoustrojów w żywności i paszach — posiew powierzchniowy na agarze PCA w 30 °C (72 h)

Mikrobiologia PN-EN ISO 4833-2

Przegląd

ISO 4833-2:2013 określa horyzontalną metodę oznaczania liczby drobnoustrojów zdolnych do wzrostu i tworzenia kolonii na powierzchni podłoża stałego po inkubacji tlenowej w 30 °C. Stosuje się ją do produktów przeznaczonych do spożycia przez ludzi lub na paszę oraz do próbek środowiskowych z produkcji i obrotu żywnością i paszami. Posiew powierzchniowy jest wskazany dla produktów zawierających organizmy wrażliwe na ciepło stanowiące znaczną część flory (np. psychrotrofy w żywności chłodzonej i mrożonej, żywność suszona), produktów z bakteriami bezwzględnie tlenowymi (np. Pseudomonas spp.), produktów z drobnymi cząstkami trudnymi do odróżnienia od kolonii w posiewie wgłębnym, produktów o intensywnej barwie utrudniającej rozpoznanie kolonii oraz gdy ocena jakości wymaga rozróżnienia typów kolonii. Oprócz ręcznego posiewu powierzchniowego norma opisuje użycie posiewacza spiralnego — szybkiej metody liczenia kolonii powierzchniowych (załącznik A).

Część 1 normy (ISO 4833-1) to posiew wgłębny w 30 °C — to ją rozporządzenie (WE) nr 2073/2005 wskazuje w kryteriach higieny procesu (liczba bakterii tlenowych w tuszach, mięsie mielonym). W Polsce obowiązuje jako PN-EN ISO 4833-2:2013-12 (wersja polska z 2017 r.; zastąpiła PN-EN ISO 4833:2004) ze zmianą A1:2022-06. Schemat metody w materiałach PIWet-PIB: naważka x g lub x ml → zawiesina wyjściowa w 9x rozcieńczalnika → posiew na PCA → inkubacja 30 °C przez 72 ± 3 h → odczyt → interpretacja → przedstawienie wyników.

Zasada metody

Określoną ilość próbki (produkt ciekły) lub zawiesiny wyjściowej (inne produkty) posiewa się powierzchniowo na stałe podłoże agarowe w płytkach Petriego; kolejne płytki przygotowuje się w tych samych warunkach z rozcieńczeń dziesiętnych. Jałową pipetą przenosi się 0,1 ml próbki lub zawiesiny wyjściowej na płytkę, 0,1 ml rozcieńczenia 10⁻¹ (produkty ciekłe) lub 10⁻² (inne produkty) na kolejną, nową pipetą, i w razie potrzeby dalsze rozcieńczenia; granicę oznaczalności można obniżyć 10-krotnie, posiewając 1,0 ml próbki lub zawiesiny wyjściowej. Inokulum rozprowadza się równomiernie i możliwie szybko po powierzchni agaru, płytki pozostawia z pokrywkami ok. 15 min w temperaturze otoczenia do wchłonięcia, odwraca i inkubuje tlenowo w 30 °C przez 72 h. Po inkubacji wybiera się płytki zawierające, o ile to możliwe, mniej niż 300 kolonii; kolonie rozpełzłe liczy się jako pojedyncze, a gdy są spodziewane, płytki ogląda się po 24 h lub 48 h i zaznacza widoczne kolonie. Liczbę drobnoustrojów na gram lub mililitr oblicza się z liczby kolonii na płytkach z mniej niż 300 kolonii. Podłoże (agar z ekstraktem drożdżowym, PCA) ma po sterylizacji pH 7,0 ± 0,2 w 25 °C (autoklaw 121 °C, 15 min); przy badaniu przetworów mlecznych dodaje się odtłuszczone mleko w proszku 1,0 g/l; do płytek wlewa się 15–20 ml podłoża, płytki można przechowywać do 4 tygodni w (5 ± 3) °C, a przed użyciem suszy się ich powierzchnię (np. w szafce 37–55 °C lub komorze laminarnej).

Zastosowania

• Żywność chłodzona i mrożona z florą psychrotrofową wrażliwą na ciepło; żywność suszona
• Produkty z bakteriami bezwzględnie tlenowymi (np. Pseudomonas spp.)
• Produkty z drobnymi cząstkami trudnymi do odróżnienia od kolonii lub o intensywnej barwie, gdzie posiew wgłębny utrudnia odczyt
• Ocena jakości wymagająca rozróżnienia typów kolonii; pasze i próbki środowiskowe
• Laboratoria o dużej przepustowości — posiew spiralny (załącznik A)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 4833-2:2013-12 + A1:2022-06 (ISO 4833-2:2013 + Amd 1:2022)

Tytuł (PL)

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda oznaczania liczby drobnoustrojów — Część 2: Oznaczanie liczby metodą posiewu powierzchniowego w temperaturze 30 °C

Title (EN)

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the enumeration of microorganisms — Part 2: Colony count at 30 °C by the surface plating technique

Procedura krok po kroku

1. Przygotowanie płytek

   Sporządź PCA (dla przetworów mlecznych z 1,0 g/l mleka odtłuszczonego), doprowadź pH tak, by po sterylizacji (121 °C, 15 min) wynosiło 7,0 ± 0,2, schłodź w łaźni 47–50 °C, wlej 15–20 ml do jałowych płytek i pozostaw do zestalenia (przechowywanie ≤ 4 tygodnie w (5 ± 3) °C). Przed posiewem osusz powierzchnię.

2. Zawiesina wyjściowa i rozcieńczenia

   Z naważki x g lub x ml sporządź zawiesinę wyjściową w 9x rozcieńczalnika i rozcieńczenia dziesiętne.

3. Inokulacja

   Jałową pipetą przenieś 0,1 ml próbki ciekłej lub zawiesiny wyjściowej na płytkę; nową pipetą 0,1 ml rozcieńczenia 10⁻¹ (ciecze) lub 10⁻² (inne produkty) na kolejną; w razie potrzeby dalsze rozcieńczenia. Dla obniżenia granicy 10× posiej 1,0 ml.

4. Rozprowadzenie

   Rozprowadź inokulum równomiernie i możliwie szybko po całej powierzchni agaru głaszczką; pozostaw płytki z pokrywkami ok. 15 min w temperaturze otoczenia do wchłonięcia.

5. Inkubacja

   Odwróć płytki i inkubuj w cieplarce w 30 °C przez 72 h.

6. Liczenie

   Wybierz płytki z (o ile to możliwe) mniej niż 300 koloniami. Kolonie rozpełzłe licz jako pojedyncze; gdy są spodziewane, obejrzyj płytki po 24 h lub 48 h i zaznacz widoczne kolonie.

7. Wynik

   Oblicz liczbę drobnoustrojów na gram lub mililitr próbki i przedstaw wynik wg normy.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Hodowle mieszanej flory z żywności — praca aseptyczna, autoklawowanie zużytych płytek
• Stopiony agar 47–50 °C i autoklaw — ryzyko poparzenia
• Posiewacz spiralny — dezynfekcja układu dozującego zgodnie z instrukcją producenta

Najczęstsze pytania