🧫 Ogólna liczba mikroorganizmów 22°C
Oznaczanie ogólnej liczby kolonii mikroorganizmów zdolnych do wzrostu w 22±2°C po 68±4 h metodą posiewu wgłębnego w agarze z ekstraktem drożdżowym. Wskaźnik jakości wody pitnej.
Przegląd
Ogólna liczba mikroorganizmów w 22°C (HPC 22 — Heterotrophic Plate Count) jest podstawowym parametrem mikrobiologicznym wody pitnej, odzwierciedlającym ogólny stan sanitarny wody i efektywność procesów uzdatniania. Wynik wyrażany jest jako liczba jednostek tworzących kolonie (jtk) w 1 mL próbki.
Mikroorganizmy rosnące w temperaturze 22±2°C po 68±4 godzinach to głównie bakterie środowiskowe (autochtoniczne), naturalnie występujące w wodzie i glebie. Należą do nich m.in. Pseudomonas, Aeromonas, Flavobacterium, Caulobacter, Arthrobacter i inne. Ich obecność w wodzie pitnej w umiarkowanych ilościach jest naturalna, jednak nagły wzrost liczebności może wskazywać na: wtórne zanieczyszczenie sieci, zastoje wody, uszkodzenie rur, tworzenie biofilmu lub nieskuteczną dezynfekcję.
Metoda według PN-EN ISO 6222:2004 polega na posiewie wgłębnym (pour plate) — odmierzoną objętość próbki (1 mL) wprowadza się do sterylnej szalki Petriego, zalewa rozstopionym i schłodzonym agarem z ekstraktem drożdżowym (YEA — Yeast Extract Agar), miesza delikatnie i po zestaleniu inkubuje w 22±2°C przez 68±4 godziny. Kolonie rosną zarówno na powierzchni, jak i wewnątrz agaru.
Wartość normatywna dla wody pitnej: brak wymagań liczbowych w Rozporządzeniu MZ, ale wymagana jest „brak nieprawidłowych zmian". W praktyce: <100 jtk/mL uznaje się za akceptowalne, >200 jtk/mL — sygnał ostrzegawczy.
Zasada metody
Metoda posiewu wgłębnego (pour plate): 1 mL próbki wody odmierza się pipetą do sterylnej szalki Petriego, a następnie zalewa 15–20 mL schłodzonego do 44–47°C rozstopionego agaru z ekstraktem drożdżowym (Yeast Extract Agar — YEA). Delikatnym ruchem obrotowym miesza się próbkę z agarem. Po zestaleniu podłoża inkubuje się w temperaturze 22±2°C przez 68±4 godziny. Mikroorganizmy zdolne do wzrostu w tych warunkach tworzą kolonie widoczne gołym okiem, które zlicza się za pomocą lupy lub automatycznego licznika.
Zastosowania
- Kontrola jakości wody pitnej (parametr wskaźnikowy wg Rozporządzenia MZ)
- Monitoring sieci wodociągowej — wykrywanie wtórnego zanieczyszczenia
- Ocena efektywności procesów uzdatniania wody
- Kontrola wody butelkowanej i źródlanej
- Badanie wody w basenach kąpielowych
- Monitoring ujęć wody podziemnej
- Ocena zastojów wody w instalacjach wewnętrznych
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Wynik | jtk/1 mL (jednostki tworzące kolonie) |
| Kryterium (woda pitna) | Brak nieprawidłowych zmian (praktycznie: <100 jtk/mL) |
| Temperatura inkubacji | 22 ± 2°C |
| Czas inkubacji | 68 ± 4 godziny (ok. 3 doby) |
| Objętość próbki | 1 mL (posiew wgłębny) |
| Podłoże | Agar z ekstraktem drożdżowym (YEA) |
Norma
- Numer normy
- PN-EN ISO 6222:2004
- Tytuł (PL)
- Jakość wody — Oznaczanie ilościowe mikroorganizmów zdolnych do wzrostu — Oznaczanie ogólnej liczby kolonii metodą posiewu w agarze odżywczym
- Title (EN)
- Water quality — Enumeration of culturable micro-organisms — Colony count by inoculation in a nutrient agar culture medium
Procedura krok po kroku
1. Przygotowanie podłoża YEA
Rozpuść agar YEA w wodzie destylowanej. Wysterylizuj w autoklawie 121°C/15 min. Po sterylizacji utrzymuj w łaźni wodnej 44–47°C (max 4 godziny).
2. Przygotowanie próbki
Próbkę wody wymieszaj delikatnie (odwracając butelkę 25 razy). Jeśli zawiera chlor, zastosuj buforek z tiosiarczanem sodu.
3. Posiew wgłębny (pour plate)
Odmierz pipetą 1 mL próbki do sterylnej szalki Petriego. Dla rozcieńczeń: 1 mL do 9 mL wody peptonowej, powtórz.
4. Zalewanie agarem
Zalej próbkę 15–20 mL rozstopionego YEA schłodzonego do 44–47°C. Natychmiast wymieszaj delikatnym ruchem obrotowym (8-ka). Unikaj pęcherzyków.
5. Zestalanie
Pozostaw szalki na poziomej powierzchni do całkowitego zestalenia agaru (ok. 15–20 min). Wykonaj duplikat dla każdej próbki.
6. Inkubacja 22°C
Umieść szalki odwrócone (dnem do góry) w inkubatorze 22±2°C. Inkubuj przez 68±4 godziny (ok. 3 doby). Nie otwieraj inkubatora bez potrzeby.
7. Odczyt wyników
Policz wszystkie widoczne kolonie (powierzchniowe i wgłębne) za pomocą lupy z podświetleniem lub automatycznego licznika. Optymalna liczba: 15–300 kolonii na szalkę.
8. Obliczenie wyniku
Wynik = średnia arytmetyczna z duplikatów × współczynnik rozcieńczenia. Podaj w jtk/1 mL. Zaokrąglij do dwóch cyfr znaczących.
9. Kontrola jakości
Kontrola negatywna: szalka z samym agarem (sterylność podłoża). Duplikat co 10 próbek. Kontrola temperatury inkubatora (rejestrator).
10. Utylizacja
Szalki po odczycie autoklawuj 121°C/30 min. Utylizuj jako odpady zakaźne.
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| Inkubator 22°C | Binder KB 53, Memmert IPP 110, Pol-Eko CLW 53 (z chłodzeniem) | 8 000–20 000 PLN |
| Łaźnia wodna 45–47°C | Memmert WNB 7, Julabo TW2 — do przetrzymywania rozstopionego agaru | 3 000–8 000 PLN |
| Autoklaw | Tuttnauer ELV 2540, Systec VX-40 | 20 000–45 000 PLN |
| Pipety automatyczne 1 mL | Eppendorf Research Plus 100–1000 µL, Gilson Pipetman L | 800–2 500 PLN/szt. |
| Szalki Petriego sterylne 90 mm | Polistyrenowe, jednorazowe, sterylne. Citotest, Gosselin | 150–300 PLN/opak. (500 szt.) |
| Lupa / licznik kolonii | Stuart SC6+, Interscience Scan 500 | 1 500–25 000 PLN |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| Agar z ekstraktem drożdżowym (YEA) | — | Yeast Extract Agar: pepton 5 g/L, ekstrakt drożdżowy 2,5 g/L, glukoza 1 g/L, agar 9–18 g/L. Producenci: Merck, Oxoid, Biokar |
| Tiosiarczan sodu (Na₂S₂O₃) | 7772-98-7 | Do neutralizacji chloru w próbkach wody sieciowej |
| Woda peptonowa buforowana | — | Do rozcieńczania próbek, sterylne buforki po 9 mL |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- Próbki wody mogą zawierać patogeny — rękawice nitrylowe, fartuch, okulary ochronne
- Roztopiony agar (44–47°C) — ryzyko oparzenia. Stosować rękawice termoodporne
- Kolonie na płytkach traktować jako potencjalnie zakaźne — autoklaw przed utylizacją
- Praca przy palniku Bunsena — zachować ostrożność, nie zostawiać bez nadzoru