🦠 Mikrocystyny (toksyny sinicowe) w wodzie — ekstrakcja do fazy stałej i HPLC z detekcją UV przy 238 nm

Mikrobiologia ISO 20179

Przegląd

Mikrocystyny to toksyny wytwarzane przez sinice; norma otwiera się ostrzeżeniem, że są silnie hepatotoksyczne dla człowieka. Nazwy wariantów pochodzą od dwóch zmiennych aminokwasów: MCYST-LR zawiera leucynę (L) i argininę (R), MCYST-RR dwie jednostki argininy, a MCYST-YR tyrozynę (Y) i argininę. Dla mikrocystyny-LR Światowa Organizacja Zdrowia zaproponowała wartość progową 1 µg/l w wodzie; norma podaje, że po zatężeniu próbki metodą SPE można tę wartość kontrolować.

ISO 20179:2005 opisuje oznaczanie i ilościowe określanie mikrocystyn w wodzie surowej zawierającej biomasę oraz w wodzie uzdatnionej, takiej jak woda wodociągowa. Metoda jest zwalidowana dla trzech wariantów: MCYST-RR, MCYST-YR i MCYST-LR. Można ją stosować także do kilku innych wariantów strukturalnych tych mikrocystyn, ale ich jednoznaczna identyfikacja nie jest możliwa — brakuje handlowych wzorców, a piki współeluują. Norma dopuszcza w załączniku A spektrometrię mas jako detekcję alternatywną.

W Polsce mikrocystyna-LR jest parametrem chemicznym wody przeznaczonej do spożycia: rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 22 maja 2026 r. (Dz. U. z 2026 r. poz. 748) ustala wartość parametryczną 1,0 µg/l z uwagą, że „parametr ten mierzy się jedynie w przypadku potencjalnych zakwitów w źródle wody (zwiększenie gęstości komórek sinicowych lub potencjał tworzenia zakwitu)", a dopuszczalną niepewność pomiaru określa na 30 % wartości parametrycznej. Rozporządzenie nie wskazuje dla tego parametru metody referencyjnej — metody referencyjne wymienia tylko dla parametrów mikrobiologicznych. Sama ISO 20179:2005 nie została wprowadzona do zbioru Polskich Norm; wydanie pierwsze pozostaje aktualne i zostało potwierdzone przez ISO w przeglądzie systematycznym zakończonym 7 kwietnia 2026 r. (etap 90.93 „norma międzynarodowa potwierdzona"). W karcie cyklu życia normy nie odnotowano ani normy zastępującej, ani poprawki (Cor/Amd).

TYTUŁ POLSKI W TYM WPISIE TO NASZE TŁUMACZENIE ROBOCZE, nie tytuł urzędowy: norma nie została wprowadzona do zbioru Polskich Norm.

Zasada metody

Próbki wody zawierające materiał sinicowy (biomasę) najpierw się sączy. Zatrzymaną biomasę ekstrahuje się osobno mieszaniną metanol/woda, ekstrakt sączy, rozcieńcza i oczyszcza metodą ekstrakcji do fazy stałej (SPE); przesącz po oddzieleniu biomasy traktuje się jak próbkę wody czystej. Próbki wody czystej, np. wodociągowej, zatęża się bezpośrednio na kolumience SPE. Mikrocystyny wymywa się z kolumienki mieszaniną metanol/woda 90/10 (v/v) zawierającą 0,1 % obj. kwasu trifluorooctowego (TFA), a oznacza ilościowo metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (RP-HPLC) z detekcją w nadfiolecie / z matrycą diodową przy długości fali 238 nm.

Zastosowania

• Kontrola wody przeznaczonej do spożycia w czasie zakwitu sinic w źródle wody (Dz. U. 2026 poz. 748: wartość parametryczna 1,0 µg/l dla mikrocystyny-LR)
• Woda surowa z ujęć powierzchniowych — jeziora i zbiorniki zaporowe podatne na zakwity
• Ocena skuteczności uzdatniania wody pod kątem usuwania toksyn sinicowych
• Woda wodociągowa rozprowadzana w sieci (próbki wody czystej zatężane bezpośrednio na SPE)
• Oznaczanie wariantów MCYST-RR i MCYST-YR obok MCYST-LR — metoda jest zwalidowana dla wszystkich trzech

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

ISO 20179:2005

Tytuł (PL)

Jakość wody — Oznaczanie mikrocystyn — Metoda z zastosowaniem ekstrakcji do fazy stałej (SPE) i wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z detekcją w nadfiolecie (UV)

Title (EN)

Water quality — Determination of microcystins — Method using solid phase extraction (SPE) and high performance liquid chromatography (HPLC) with ultraviolet (UV) detection

Procedura krok po kroku

1. Pobranie próbki

   Próbki pobierać zgodnie z normami przywołanymi w ISO 20179: ISO 5667-4 (jeziora naturalne i sztuczne) oraz ISO 5667-5 (woda do picia ze stacji uzdatniania i z sieci). Do przygotowania odczynników stosować wodę klasy 3 wg ISO 3696.

2. Ograniczenie strat na tworzywach

   W całym toku analizy unikać, gdzie to możliwe, elementów z tworzyw sztucznych (pipety, węże, kolumienki z tworzywa) — mikrocystyny adsorbują się na ich ściankach i wynik zaniża się o straty.

3. Oddzielenie biomasy

   Próbkę wody zawierającą materiał sinicowy przesączyć przez sączek z mikrowłókna szklanego o zdolności zatrzymywania 1–2 µm (średnica do 47 mm). Etap dotyczy wyłącznie próbek z fitoplanktonem; przesącz traktuje się dalej jak próbkę wody czystej.

4. Ekstrakcja biomasy

   Biomasę z sączka ekstrahować osobno mieszaniną metanol/woda 75/25 (v/v). Do rozbijania komórek i rozdzielania zawiesiny norma przewiduje sondę ultradźwiękową (ok. 60 W, ok. 20 kHz), łaźnię ultradźwiękową, wytrząsarkę poziomą oraz wirówkę o co najmniej 4000 min⁻¹ i RCF co najmniej 10 000 g. Ekstrakt przesączyć i rozcieńczyć.

5. Zatężanie na kolumience SPE

   Przesącz próbki oraz próbki wody czystej (np. wodociągowej) przepuścić przez kolumienkę SPE C-18 ze zbiorniczka 500 ml przy wspomaganiu pompą próżniową. Kolumienka musi mieć pojemność co najmniej 100 µg każdej mikrocystyny i dawać odzysk co najmniej 80 % dla MCYST-LR oraz 70 % dla MCYST-RR i -YR.

6. Przemycie i elucja

   Kolumienkę przemyć mieszaniną metanol/woda 20/80 (v/v), a mikrocystyny wymyć mieszaniną metanol/woda 90/10 (v/v) z dodatkiem 0,1 % obj. TFA. Eluat po zatężeniu rozpuścić ponownie w mieszaninie metanol/woda 20/80 (v/v).

7. Przygotowanie wzorców

   Dokładne stężenie każdego wzorca podstawowego wyznaczyć spektrofotometrycznie: rozpuścić w czystym metanolu i zarejestrować krzywą absorpcji 220–250 nm w kuwecie kwarcowej 1 cm wobec metanolu, po czym obliczyć stężenie z równania (1) przy ε = 39 800 l/(mol·cm) i masie molowej 994 (LR), 1044 (YR) lub 1037 g/mol (RR). Z mieszanego roztworu podstawowego 2,5 µg/ml (przechowywanego poniżej −16 °C) sporządzić pięć wzorców: 0,2; 0,4; 1,0; 2,0 i 3,0 µg/ml.

8. Rozdział chromatograficzny

   Rozdział prowadzić w odwróconym układzie faz. Norma podaje PRZYKŁADOWY gradient (tablica 1, w normie opisana jako „an example”; to punkt wyjścia do optymalizacji na własnej kolumnie, a nie wymaganie): 0 min 30 % A / 70 % B, 10 min 35/65, 40 min 70/30, 42–44 min 100/0, 46–55 min powrót do 30/70; przepływ 0,3–1,0 ml/min zależnie od kolumny (A — acetonitryl z TFA, B — woda z TFA; obie fazy odgazować przed użyciem).

   ⏱ Czas: 55 min na analizę

9. Detekcja i obliczenie wyniku

   Mikrocystyny oznaczyć ilościowo z detekcji UV / DAD przy 238 nm, odnosząc powierzchnie pików do krzywej wzorcowej. Wynik odnieść do wartości 1 µg/l mikrocystyny-LR (WHO; w Polsce wartość parametryczna 1,0 µg/l).

10. Kontrola metody

    Równolegle badać próbkę wzbogaconą: roztwór kontrolny o stężeniu 1 µg/l każdej z trzech mikrocystyn, sporządzony przez rozcieńczenie 200 µl mieszanego roztworu podstawowego do 500 ml wodą wodociągową lub wodą z jeziora bez toksyn.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Mikrocystyny są silnie hepatotoksyczne dla ludzi — norma umieszcza ostrzeżenie już w nagłówku; pracę z roztworami wzorcowymi prowadzić w rękawicach, pod wyciągiem
• Odpady laboratoryjne zawierające mikrocystyny zbierać osobno i unieszkodliwiać jako odpad chemiczny wysoce toksyczny; dopuszczalna jest długotrwała dekontaminacja stężonym roztworem podchlorynu sodu (NaClO)
• Badanie mogą wykonywać wyłącznie osoby odpowiednio przeszkolone — norma stawia to jako warunek bezwzględny
• Metanol i acetonitryl są łatwopalne i toksyczne, kwas trifluorooctowy działa żrąco — praca pod wyciągiem, w rękawicach i okularach ochronnych
• Ze względu na palne rozpuszczalniki ekstrakcyjne norma zdecydowanie zaleca wirówkę w wykonaniu przeciwwybuchowym

Najczęstsze pytania